1.6 观察指标
体重、血红蛋白、红细胞内游离原卟啉

1.6.1 血红蛋白测定（氰化高铁法）
消光系数法和标准曲线法任选其一测定血红蛋白。
1.6.1.1 消光系数法
1.6.1.1.1 原理
血红蛋白（haemoglobin, Hb）被铁氰化钾氧化后生成高铁血红蛋白，再与氰离子结合形成氰化高铁血红蛋白（红色）, 氰化高铁血红蛋白（红色）极为稳定，在540nm波长下，毫克分子消光系数为44，据此，用分光光度法测其光密度，运用消光系数作血红蛋白的定量测定。
1.6.1.1.2 仪器
721型或其它型号的分光光度比色计。
10微升微量吸管。
1.6.1.1.3 试剂
称取碳酸氢钠(NaHCO3,AR)140毫克、铁氰化钾200毫克、氰化钾50毫克，用水溶解并稀释到1000毫升。贮存於棕色试剂瓶内，在暗处或冰箱(+4℃)保存，至少可稳定数月到1年。
1.6.1.1.4 实验步骤
1.6.1.1.4.1 取试剂2.5毫升於5毫升带盖试管中，加入10微升血液，混匀后，放置15分钟。
1.6.1.1.4.2 选用0.5厘米光径比色杯，于540nm波长下，以试剂调零点，将所得样品管之光密度乘以73.6，即为血红蛋白之浓度(克%)。

计算公式如下：

D 540
HiCN
×251 64458
540
Ct= ────────
44×0.5 ×───
10000 = D HiCN ×73.6

Ct=待测的血红蛋白（克%）浓度。
D 540
HiCN =氰化高铁血红蛋白在540nm波长下测出的光密度。

251=测定时血液的稀释倍数(血10微升加入试剂2.5毫升中)
44=氰化高铁血红蛋白的毫克分子消光系数
0.5=比色杯的光径
64458=血红蛋白的分子量
10000=将(毫克/升)换算成（克%）的数字

1.6.1.1.5 注意事项
1.6.1.1.5.1 试剂不要放在聚乙烯瓶内，以免因氰离子与其反应而使试剂作用降低。
1.6.1.1.5.2 仪器因mM消光系数法完全依靠仪器的吸光度来计算，故此法要求所用的仪器性能要符合要求（如仪器的波长准确与否，以及灵敏度及线性等），否则将直接影响测定的结果。
1.6.1.1.5.3 仪器在使用前最好应以WHO规定的氰化高铁血红蛋白参考液校正后再使用。参考液最好选用ICSH（国际血液学标准化委员会）确定的由RIV（荷兰国立公共卫生研究院）制作的氰化高铁血红蛋白参考液或上海医学化验所制备的氰化高铁血红蛋白标准液。

1.6.1.2 标准曲线法
1.6.1.2.1 原理
血红蛋白(hemoglobin,Hb)在铁氰化钾和氰化钾的作用下生成极为稳定的氰化高铁血红蛋白（红色），其颜色深浅与血红蛋白的含量成正比。用分光光度计在540nm波长下，测定血红蛋白标准品和参考标准物质的吸光度，制成标准曲线，测得待测样品的吸光度后查标准曲线即可得Hb的浓度。
1.6.1.2.2 仪器
10μL血色素吸管（或定量毛细管）
5毫升或10毫升带盖试管
721、722、或723型等型号的分光光度计
1.6.1.2.3 试剂
称取碳酸氢钠(NaHCO3,AR)140mg、铁氰化钾200mg、氰化钾50mg,用蒸馏水溶解并稀释到1000mL.贮存于棕色试剂瓶内，保存于4oC冰箱可稳定至1年。
1.6.1.2.4 实验步骤
吸取2.5mL试剂于5mL带盖试管中，用10μL血色素吸管(或定量毛细管)取大鼠尾血或静脉血10μL放置于已放入试剂的试管中；混匀放置15分钟。
选用0.5cm光径比色杯，于540nm波长下，以试剂调节仪器零点，测定各样品管的吸光度，同时测定血红蛋白标准和参考标准物质的吸光度，绘制血红蛋白的标准曲线。查标准曲线可求得待测样品和参考标准物质得血红蛋白含量g/dl或g/l，计算参考物质的回收率。、

1.6.1.2.5 注意事项
1.6.1.2.5.1 不要将试剂放在聚乙烯瓶内，以免因氰离子与其反应而使试剂作用降低。
1.6.1.2.5.2 不宜直接使用消光系数方法计算血红蛋白的含量，因为仪器的波长准确与否仪器的灵敏度和线性等因素均直接影响测定结果。
1.6.1.2.5.3 每次测定时，在不同间隔反复测定血红蛋白标准液和参考标准物质（低、中、高3个浓度）。

1.6.1.3 数据处理及结果判定
实验数据可用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值< F0.05,结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

结果判定
受试样品组与对照组比较，血红蛋白浓度升高经统计处理差异有显著性，且受试样品组前后升高幅度平均达到10g/L以上，判定该受试样品有升高血红蛋白作用，动物实验结果阳性。

1.6.2 红细胞内游离原卟啉测定
1.6.2.1 原理
血红蛋白的合成过程中，幼红细胞中的原卟啉在血红素合成酶的作用下与铁结合，当铁供应不足时，红细胞内的原卟啉乃以游离形式累积起来超过正常水平。因此，检测红细胞内游离原卟啉（Free erythrocyte proloporphyrin, FEP）的含量是检查缺铁性红细胞生成的有效方法。
血液样品经生理盐水稀释后，分别以乙酸乙酯：乙酸混合液（4:1）和0.5N盐酸提取分离血中游离原卟啉，在一定波长下测定其原卟啉的荧光强度而定量。
1.6.2.2 仪器
1.6.2.2.1 荧光分光光度计或930型荧光光度计。
1.6.2.2.2 离心机。
1.6.2.2.3 混旋器。
1.6.2.3 试剂
1.6.2.3.1 肝素抗凝剂 一支12500单位的肝素以0.9%生理盐水稀释至25mL(1mL=500单位)。
1.6.2.3.2 5%（W/V）硅藻土生理盐水悬浮液 称取5g硅藻土加0.9%生理盐水至100mL。
1.6.2.3.3 4:1乙酸乙酯和乙酸混合液。
1.6.2.3.4 0.5N HCl。
1.6.2.3.5 原卟啉标准液。
1.6.2.3.5.1 原卟啉标准贮备液（50µg/mL）：称取5mg原卟啉，加4mL无水乙醇使之溶解，以1.5N HCl稀释至100mL。
1.6.2.3.5.2 原卟啉标准中间液（1.0µg/mL）：取2mL原卟啉贮备液，以乙酸乙酯与乙酸(4:1)混合液稀释到100mL。
1.6.2.3.5.3 原卟啉标准应用液（0.1µg/mL）：取0.1mL原卟啉中间液，以乙酸乙酯与乙酸(4:1)混合液稀释到10mL。

1.6.2.4 实验步骤
试 剂 样品管 空白管 标准管
肝素(mL) 0.10 0.10 0.10
全血(mL) 0.02 — —
水 (mL) — 0.02 0.02
5%硅藻土悬浮液(mL) 0.15 0.15 0.15
原卟啉标准应用液(mL) — — 0.5
乙酸乙酯与乙酸(4:1)混合液(mL) 4 4 3.5
注：按上表依次加入各种试剂，在加入乙酸乙酯与乙酸混合液前，用混旋器混合已加入的混合液，然后边混合边加入乙酸乙酯与乙酸混合液。
离心15分钟，将各管上清液分别倒入10mL比色管中，每管加4mL 0.5N盐酸，振摇5分钟静止使之分层，将上层溶剂抽出弃去，测定盐酸液的荧光强度（30分钟内比色）。

1.6.2.5 荧光测量
1.6.2.5.1 若使用日立MPF-4型荧光分光光度计测定条件为激发波长为403nm，狭缝10nm;发射波长为605nm，狭缝为5nm，液槽为1cm厚石英槽。
1.6.2.5.2 若使用国产930型荧光光度计测试，条件为激发滤光片420，荧光滤片550，灵敏度1×500，满度开关开至最大，液槽为1cm厚石英槽，检出灵敏度为0.01µg/4mL。在不同量原卟啉（0µg，0.01µg，0.03µg，0.05µg，0.07µg，0.1µg）呈线性关系。

1.6.2.6 计算

样品荧光强度-空白荧光强度
血中原卟啉含量(µg/100mL全血) = ───────────────×标准管
标准管荧光强度-空白荧光强度
100
原卟啉含量(µg)×──────
样品取样量mL

1.6.2.7 数据处理及结果判定
实验数据可用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值< F0.05,结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

结果判定
受试样品组与对照组比较， 红细胞内游离原卟啉降低经统计处理差异有显著性，即可判定该受试样品有降低红细胞内游离原卟啉的作用，动物实验结果阳性。

1.6.2.8 注意事项
1.6.2.8.1 荧光强度随时间延长而逐渐衰退，但30分钟内基本稳定。
1.6.2.8.2 加乙酸乙酯-乙酸混合液时，一定要边混合边加入，否则影响测定结果。
1.6.2.9 滤纸法测定：
将滴有20微升血点全部剪下放入试管中，同时取同样大小空白滤纸放入标准管和空白管中，各管均加入5%硅藻土悬浮液0.2亳升，振荡后放置过夜，以下步骤同直接法。
计算 FEP（微克/100毫升全血）=C/B×A/D×100
A=标准管原卟啉含量（0.02毫克）
B=标准管荧光强度-空白管荧光强度
C=血样荧光强度-空白管荧光强度
D=取样量

1.7 数据处理和结果判定
实验数据可用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值< F0.05,结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。
结果判定
受试样品组与低铁对照组相比，若血红蛋白差异有显著性，且其前后平均升高幅度达到10g/L以上，受试样品红细胞内游离原卟啉两项指标与低铁对照组相比差异有显著性，可判定该受试样品改善营养性贫血功能动物实验结果阳性。

1.8 注意事项
本项实验关键在于贫血模型的建立。低铁饲料含铁量最好控制在9mg/Kg以下，所用试剂应为分析纯，动物饮用水应为去离子水或双蒸水，采用不锈钢笼具，所用器皿应用10%硝酸溶液处理。实验过程中严防外来铁的污染及彼此交叉污染。

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