动物实验

    1 负重游泳实验
1.1 检验原理
运动耐力的提高是抗疲劳能力加强最直接的表现，游泳时间的长短可以反应动物运动疲劳的程度。
1.2 仪器与器材
游泳箱（大小约50cm×50cm×40cm），电子天平、铅皮。
1.3 实验方法
1.3.1 实验动物  推荐使用纯系小鼠，成年小鼠，体重18－22g，。
1.3.2 剂量分组及受试样品给予时间
实验设三个剂量组和一个空白对照组，以人体推荐量的10倍为其中的一个剂量组，另设二个剂量组，必要时设阳性对照组。受试样品给予时间30天，必要时可延长至45天。
1.3.3 实验步骤
末次给予受试样品30min后（酒类样品测试当天可以不灌胃），置小鼠在游泳箱中游泳。水深不少于30cm，水温25℃±1.0℃，鼠尾根部负荷5％体重的铅皮。记录小鼠自游泳开始至死亡的时间，作为小鼠游泳时间。
1.4 数据处理及结果判定
游泳时间为计量资料，采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值< F0.05,结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。
若受试样品组游泳时间明显长于对照组，且差异有显著性，可判定该实验结果阳性。
1.5 注意事项
1.5.1 每一游泳箱一次放入的小鼠不宜太多，否则互相挤靠，影响实验结果。
1.5.2 水温对小鼠的游泳时间有明显的影响，因此要求各组水温控制一致，每一批小鼠下水之前都应测量水温，水温以25℃为宜，如果过低可能引起小鼠痉挛，影响实验结果，过高（30℃）则游泳时间太长不便于操作。
1.5.3 铅皮缠绕松紧应适宜。
1.5.4 观察者应在整个实验过程中使每只小鼠四肢保持运动。如果小鼠漂浮在水面四肢不动，可用木棒在其附近搅动。
1.5.5 不同批的小鼠因饲养环境、季节等原因的变化体质上会出现差异。因此受试样品组和对照组应采用同一批动物同时进行实验。
 
    2 血清尿素测定
全自动生化仪测定和二乙酰—肟法任选一种。
2.1 全自动生化仪测定：按有关仪器说明书和试剂盒操作。
2.2 二乙酰—肟法
2.2.1原理
样品中尿素在氯化高铁—磷酸溶液中与二乙酰—肟和硫氨脲共煮，形成一种红色的化合物Diazine，其颜色的深浅与尿素含量成正比。与同样处理的尿素标准管比较，可求出尿素的含量。
2.2.2 仪器和试剂
2.2.2.1 721分光光度计，10mL 带塞试管，1mL（或1.5mL）塑料离心管，电炉，锅，灌胃针头。
2.2.2.2 尿素试剂盒（二乙酰－肟法）：二乙酰-肟应用液、氯化铁－磷酸应用液、尿素标准液（20.0 mg/dL）。
2.2.2.3 若无试剂盒，可自行配制试剂。试剂配制方法如下：
1g/L 二乙酰—肟溶液：取二乙酰—肟1.0g，氨基硫脲（thiosemicarbazide）0.2g，氯化钠4.5g，溶于蒸馏水并加至1000mL。
33g/L 三氯化铁溶液：取三氯化铁1.0g溶于浓磷酸20mL 中，加蒸馏水10mL，摇匀。
酸溶液：取蒸馏水800mL，慢慢加入浓硫酸50mL，边加边摇；再加入85％磷酸50mL，摇匀。加入33g/L 三氯化铁溶液1.5mL，加水至1L。
10 m mol/L 尿素标准液（尿素28.01mg/dL）：精确称取尿素（AR）150.3mg 溶于16 m mol/L 苯甲酸溶液并加至250mL。
16 m mol/L 苯甲酸液：取苯甲酸2.0g 溶于蒸馏水1000mL 中，加浓硫酸0.8mL。
2.2.3 实验方法
2.2.3.1 实验动物  成年小鼠或大鼠，小鼠体重18-22g，Wistar 或SD大鼠体重160-200g。推荐使用雄性小鼠。
2.2.3.2 剂量设计和分组  大鼠以人体推荐量的5倍为基本剂量。其余同1.1.3.2。
2.2.3.3 实验步骤
2.2.3.3.1 高尿素模型的建立及标本制备：末次给受试样品30min 后，在温度为30℃的水中不负重游泳90min ，休息60min后采血。大鼠采尾血，小鼠拔眼球采全血约0.5mL（不加抗凝剂）。置4℃冰箱约3h,血凝固后2000prn/min离心15min,取血清备用。血清中的尿素在室温下可稳定24h，在4-6℃可稳定7天以上。用二乙酰-肟法测定。
2.2.3.3.2 试剂盒操作步骤（本推荐使用的试剂盒适用于手工操作）
  测定管 标准管 空白管
尿素标准液（mL） -- 0.02 --
标本（mL） 0.02 -- --
二乙酰肟应用液（mL） 3.00 3.00 3.00
氯化铁－磷酸应用液（mL） 2.50 2.50 2.50
充分混匀，置沸水浴中煮沸10分钟，再于冷水中冷却。在520nm波长处（或绿色滤光板），以蒸馏水调零，测定各管吸光度值。
计算公式：
　　　　　　　　测定管光密度－空白管光密度
尿素（mg/dL）=-------------------------------------×标准液浓度值
　　　　　　　　标准管光密度－空白管光密度
 
　　　　　　　　测定管光密度－空白管光密度
尿素（m mol/L）=-----------------------------------×标准液浓度值÷2.8
　　　　　　　　标准管光密度－空白管光密度
 
标准液浓度值为20.0mg/dL。
 
2.2.3.3.3 自行配制试剂按下表操作：
试剂 测定 标准管 空白管
血浆/血清(mL) 0.05 — —
10mmol/L 尿素标准液(mL) — 0.05 —
蒸馏水(mL) — — 0.05
1g/L 肟溶液(mL) 2.5 2.5 2.5
酸溶液(mL) 2.5 2.5 2.5
充分混匀，置沸水浴准确15min，立即用自来水冷却。用波长520nm，以空白管调零，读取各管吸光度（A值）。
 
尿素含量计算
尿素（mmol/L）＝Au×10/As
尿素（mg/dL）＝Au×28.01/As
式中  Au－测定管吸光度
As－标准管吸光度
 
2.3 数据处理及结果判定
尿素数据为计量资料，可用方差分析,但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值< F0.05,结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。
若受试样品组血清尿素低于对照组，且差异有显著性，可判定该实验结果阳性。
2.4 注意事项
2.4.1 为避免色度转移，应在标本加入后30min 内读出吸光度值。
2.4.2 一般标本测定管反应后应澄清，严重脂血可制备血滤液重新测定。
2.4.3 煮沸时间应准确。

    3 肝糖原测定：蒽酮法。
3.1 检测原理
蒽酮可与游离糖或多糖起反应，反应后溶液呈蓝绿色，于620nm处有最大吸收。测定其光密度，可以确定糖原的含量。
3.2 仪器和试剂
2.2.1 仪器：721型分光光度计，离心机，扭力天平，匀浆器，振荡器，移液泵，沸水浴，灌胃针头，手术器械，玻璃漏斗，加样器，2mL、5mL、10mL 吸量管，20mL 带塞刻度试管，10mL 带塞离心管。
3.2.2 试剂：5％三氯醋酸（用蒸馏水配）（TCA），葡萄糖标准液，浓硫酸（AR），蒽酮试剂。
蒽酮试剂：溶液中含0.05％的蒽酮，1％的硫脲，用72％的H 2SO4配制。配制方法如下：
①72％H 2SO4配制：烧杯中加入280mL蒸馏水，再加入高纯度的浓硫酸720mL(比重1.84)。
②蒽酮试剂配法：当H2SO4 温度降至80-90℃时放入500mg纯的蒽酮，10g高纯度的硫脲，适当摇动烧杯混匀。冷却后存放于冰箱中，可保存两周。
3.3 实验方法
3.3.1 实验动物  同1.2.3.1
3.3.2 剂量设计和分组
大鼠剂量以人体推荐食用量扩大5倍作为基本剂量，其余同1.3.2。
3.3.3 实验步骤
末次给样后30min处死动物，取肝脏经生理盐水漂洗后用滤纸吸干，精确称取肝脏100mg，加入8mL TCA，每管匀浆1min，将匀浆液倒入离心管，以3000转/min 离心15min，将上清液转移至另一试管内。
取1mL上清液放入10mL离心管中（每样品可做两平行管以保证获得可靠结果），每管加入95％的乙醇4mL，充分混匀至两种液体间不留有界面。用干净塞子塞上，室温下竖立放置过夜（也可选用将试管放在37-40℃水浴3h）。沉淀完全后，将试管于3000转/min 离心15min。小心倒掉上清液并使试管倒立放置10min。
用2mL蒸馏水溶解糖原，加水时将管壁的糖原洗下。如管底的糖原不立即溶解，振荡管子直到完全溶解。
制作试剂空白和标准管：
试剂空白：吸2mL蒸馏水到干净离心管
标准管：吸0.5mL葡萄糖标准液（含100mg/dL葡萄糖）和1.5mL蒸馏水放入同样的管子。
此时将10mL蒽酮试剂用力加入各管，液流（蒽酮试剂）直接进入管子中央，保证充分混合好。从管子中注入蒽酮试剂时起，将管子放在冷水龙头下冲凉。在所有管子都达到凉水温度后，将其浸于沸水浴（水浴深度略高于管子液面）15min，然后移到冷水浴，冷却到室温。将管内液体移入比色管，在620nm波长下，用试剂空白管调零后测定吸光度。并根据标准曲线计算出糖原含量，根据所称取的肝脏重量换算成肝糖原含量（以mg/g 肝表示），并进行统计分析。

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