1 动物实验
1.1 动物选择
选用12月龄以上老龄大鼠或8-12月龄老龄小鼠，也可用25－30g成年小鼠造模。测定GSH、SOD指标时，可以选用正常成年动物。单一性别，小鼠每组10－15只，大鼠8－12只。
1.2 剂量分组及受试样品给予时间
实验设三个剂量组和一个空白对照组和一个模型对照组，以人体推荐量的5倍为其中的一个剂量组，另设二个剂量组，必要时设阳性对照组。受试样品给予时间30天，必要时可延长至60天。
1.3 实验方法
1.3.1 老龄动物
选用12月龄大鼠或8-12月龄小鼠，按血中MDA水平分组，随机分为1个老龄对照组和3个受试样品剂量组。每组大鼠单一性别8－12只，小鼠单一性别10－15只。3个剂量组给予不同浓度受试样品，对照组给予同体积溶剂，实验结束时处死动物测过氧化脂质含量、抗氧化功能酶活力。
1.3.2 过氧化损伤模型
1.3.2.1 D－半乳糖模型
1.3.2.1.1原理
D-半乳糖供给过量，超常产生活性氧，打破了受控于遗传模式的活性氧产生与消除的平衡状态，引起过氧化效应。
1.3.2.1.2造模方法
选三月龄健康成年小鼠，用 D－半乳糖40mg－1.2g/kgBW颈背部皮下注射或腹腔注射造模，注射量为0.1mL/10g，每日1次，连续造模6周，取血测MDA，按MDA水平分组。随机分为1个模型对照组和3个受试样品剂量组，另设1个空白对照组，3个剂量组经口给予不同浓度受试样品，模型对照组和空白对照组给予同体积溶剂，在给受试样品的同时，除空白对照组外，各组继续给予相同剂量D-半乳糖颈背部皮下或腹腔注射，空白对照组皮下注射生理盐水，实验结束处死动物测过氧化脂质含量和抗氧化功能酶活力。
1.3.2.2 辐照模型
1.3.2.2.1原理
电离辐射通过直接破坏生物膜中不饱和脂肪酸和间接通过水辐解产生自由基，引发脂类过氧化。
1.3.2.2.2造模方法
选18－22g健康成年小鼠，随机分5个组，1个空白对照组，1个模型对照组和3个受试样品剂量组，3个剂量组给予不同浓度受试样品，对照组给予同体积溶剂，30天后，除空白对照组外，各组给予5－8Gy60Coγ射线全身1次性照射，照射后第3、4天处死动物，取肝组织（或第9、10天处死动物，取睾丸组织）测过氧化脂质含量和抗氧化功能酶活力。
1.3.2.3 溴代苯模型
1.3.2.3.1原理
溴代苯导致小鼠肝中毒，引起肝脂质过氧化。
1.3.2.3.2造模方法
选18－22g健康成年小鼠，随机分5个组，1个空白对照组，1个模型对照组和3个受试样品剂量组，3个剂量组给予不同浓度受试样品，对照组给予同体积溶剂，实验30天后，动物饥饿过夜，给受试样品0.5-1小时后，除空白对照组外，各组灌胃0.16-0.47mg/kgBW溴代苯油，灌胃量0.2mL/20g，空白对照组灌胃同体积植物油，大约18－22小时后处死动物，取肝组织测过氧化脂质含量和抗氧化功能酶活力。
1.3.3 过氧化脂质（LPO）含量测定
脂质过氧化可以形成丙二醛、乙烷、共轭二烯、荧光产物及能产生化学发光的物质。如果这些产物在体液和组织中的含量增多，则表明体内脂质过氧化反应增强。
1.3.3.1 血中过氧化脂质降解产物丙二醛（MDA）含量测定
血中过氧化脂质降解产物丙二醛（MDA）含量可采用荧光法和比色法测定，方法任选其一。
1.3.3.1.1 荧光法
1.3.3.1.1.1 荧光法原理
MDA（malondiadehycle）是细胞膜脂质过氧化的终产物之一，测其含量可间接估计脂质过氧化的程度。1个丙二醛（MDA）分子与2个硫代巴比妥酸（TBA）分子在酸性条件下共热，形成粉红色复合物。以波长536nm为激发光，在550nm有最强荧光强度。可用荧光法进行微量测定。
1.3.3.1.1.2 仪器与试剂
仪器 荧光分光光度计、微量加样器、恒温水浴锅、普通离心机、混旋器、具塞离心管
试剂
10mmol/L四乙氧基丙烷（贮备液，棕色瓶4℃保存12个月），临用前用纯水稀释成1nmol/mL
29mmol/L硫代巴比妥酸工作液
硫代巴比妥酸 0.209g
EDTA.2H20 25mg
谷胱甘肽(还原型) 1mg
用0.02mol/L NaOH 50 mL 溶解(微温助溶 ，棕色瓶4℃保存2周)
酸水解液
0.1mol/L H2SO4 125mL
0.1mol/L Na2SO4 125mL
加水150mL用 H2SO4 调PH 1.5,加水稀释至500mL
正丁醇
以上所用玻璃器皿均需经50％硝酸浸泡24h后，再经蒸馏水、双蒸水淋洗干燥，试剂（选AR级）最好用双蒸水配制。
1.3.3.1.1.3 实验步骤
1.3.3.1.1.3.1 样品制备
全血样品：取血50μl加入0.5mL生理盐水，2000r/min离心10min，取上清液待测。血清样品：取血0.5mL室温静置10min，2000r/min离心10min，取上清液待测。
1.3.3.1.1.3.2 标准曲线制作
将10nmol/mL四乙氧基丙烷，用双蒸水稀释成0.0、0.25、0.5、1.0、1.5、2、3、5、10nmol/mL分别取0.1mL加入酸水解液 2mL、TBA工作液0.5mL→混匀，避光、沸水浴60min→流水冷却至室温→3mL正丁醇振荡抽提1min→3000r/min离心5min→取上清液（正丁醇层）测荧光强度（入射狭缝1.5nm，出射狭缝5nm， 激发波长536nm，发射波长550nm）
以四乙氧基丙烷浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标作图。
1.3.1.1.3.3样品测定
试剂 空白管 样本管 标准管
10mL具塞离心管 0.1mL蒸馏水 0.1mL血清* 0.1mL标准＃
酸水解液 2mL 2mL 2mL
TBA工作液 0.5mL 0.5mL 0.5mL
混匀，避光沸水浴60min，流水冷却
正丁醇 3mL 3mL 3mL
振荡抽提1min，3000转/分 离心5分钟
*全血 0.5mL(空白管加蒸馏水0.5mL，标准管加标准0.1mL、蒸馏水0.4mL)
＃1nmol/mL四乙氧基丙烷(标准)
血清0.1mL（或全血上清液0.5mL）→加入酸水解液 2mL、TBA工作液0.5mL→混匀，避光、沸水浴60min→流水冷却至室温→3mL正丁醇振荡抽提1min→3000r/min离心5min→取上清液（正丁醇层）测荧光强度（入射狭缝1.5nm，出射狭缝5nm， 激发波长536nm，发射波长550nm）
1.3.3.1.1.3.4 计算公式：
B-A B-A 1
过氧化脂质含量（nmol/mL血清） ＝── ×C×K ＝──× 1 ×──
F-A F-A 0.1
B-A B-A 1
过氧化脂质含量（nmol/mL血液）＝ ──×C×K＝──× 1×──
F-A F-A 0.05
A: 空白管荧光度
B：样品荧光度
F：四乙氧基丙烷荧光度
C：四乙氧基丙烷浓度(1nmol/mL)
K：稀释倍数
1.3.3.1.1.4 数据处理及结果判定
一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值< F0.05,结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。
受试样品组与模型（或老龄）对照组比较，过氧化脂质含量降低有统计学意义，判定该受试样品有降低脂质过氧化作用，实验结果阳性。
1.3.3.1.2比色法
1.3.3.1.2.1比色法原理
MDA（malondiadehycle）是细胞膜脂质过氧化的终产物之一，测其含量可间接估计脂质过氧化的程度。1个丙二醛（MDA）分子与2个硫代巴比妥酸（TBA）分子在酸性条件下共热，形成粉红色复合物。该物质在波长532nm有极大吸收峰。可用分光光法进行测定。
1.3.3.1.2.2 仪器与试剂
仪器 721分光光度计、微量加样器、恒温水浴锅、普通离心机、混旋器、具塞离心管。
试剂0.2M乙酸盐缓冲液 PH3.5
0.2M乙酸溶液 185mL
0.2M乙酸钠溶液 15mL
1mmol/L四乙氧基丙烷（贮备液，4℃保存3个月），临用前用水稀释成40nmol/mL
8.1%十二烷基硫酸钠SDS
0.8%硫代巴比妥酸TBA
0.2M磷酸盐缓冲液 PH7.4
0.2M磷酸氢二钠 1920mL
0.2M 磷酸二氢钾 480mL
1.3.3.1.2.3 实验步骤
1.3.3.1.2.3.1 样品制备
全血样品：取血20μL加入0.98mL蒸馏水制成2％溶血液。
1.3.3.1.2.3.2样品测定
试剂 空白管 样品管 标准管
2％溶血液 0.2mL
40nmol/mL四乙氧基丙烷 0.2mL
8.1%SDS 0.2mL 0.2mL 0.2mL
0.2M乙酸盐缓冲液 1.5mL 1.5mL 1.5mL
0.8%TBA 1.5mL 1.5mL 1.5mL
H2O 0.8mL 0.6mL 0.6mL
混匀，避光沸水浴60min，流水冷却，于532nm比色
注：如用试剂盒，可按试剂盒的操作要求进行。
1.3.3.1.2.3.3计算
B-A B-A
过氧化脂质含量（nmol/mL2:98溶血液）＝── ×C×K ＝──×40
F-A F-A
A: 空白管吸光度
B：样品吸光度
F：四乙氧基丙烷吸光度
C：四乙氧基丙烷浓度(40nmol/mL)
K：稀释倍数
1.3.3.1.2.4数据处理及结果判定
一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值< F0.05,结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。
受试样品组与模型（或老龄）对照组比较，过氧化脂质含量降低有统计学意义，判定该受试样品有降低脂质过氧化作用，实验结果阳性。
1.3.3.2组织中过氧化脂质降解产物丙二醛（MDA）含量测定
1.3.3.2.1 原理
见1.3.3.1.2.1
1.3.3.2.2 仪器与试剂
仪器 721分光光度计、微量加样器、恒温水浴锅、普通离心机、混旋器、具塞离心管、组织匀浆器
试剂 见1.3.3.1.2.2
1.3.3.2.3 实验步骤
1.3.3.2.3.1 样品制备
组织匀浆样品：取一定量的所需脏器，生理盐水冲洗、拭干、称重、剪碎，置匀浆器中，加入0.2M磷酸盐缓冲液，以20000r/min匀浆10s，间歇30s，反复进行3次，制成10％组织匀浆（W/V），3000r/min离心5～10min，取上清液待测。
1.3.3.2.3.2样品测定
6试剂 空白管 样品管 标准管
10％组织匀浆 0.1mL
40nmol/mL四乙氧基丙烷 0.1mL
8.1%SDS 0.2mL 0.2mL 0.2mL
0.2M乙酸盐缓冲液 1.5mL 1.5mL 1.5mL
0.8%TBA 1.5mL 1.5mL 1.5mL
H2O 0.8mL 0.7mL 0.7mL
混匀，避光沸水浴60min，流水冷却，于532nm比色
注：如用试剂盒，可按试剂盒的操作要求进行
1.3.3.2.3.3计算
B-A B-A 1
过氧化脂质含量（nmol/mg组织）＝── ×C×K ＝──×40×────
F-A F-A 0.1×1000
B-A B-A 1 1
过氧化脂质含量 ＝─── ×C×K ＝───×40×─── ×────── ×100
(nmol/100mg蛋白质) F-A F-A 0.1 每克组织蛋白mg
A: 空白管吸光度
B：样品荧吸光度
F：四乙氧基丙烷吸光度
C：四乙氧基丙烷浓度(40nmol/mL)
K：稀释倍数
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