1.3.3.2.3.4 数据处理及结果判定
一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值< F0.05,结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。
受试样品组与模型（或老龄）对照组比较，过氧化脂质含量降低有统计学意义，判定该受试样品有降低脂质过氧化作用，实验结果阳性。
1.3.3.3 组织中脂褐质（Lipofasci）含量测定
1.3.3.3.1 原理
脂褐素是丙二醛与游离氨基的物质（如磷脂酰乙醇胺、蛋白质及核酸）交联而生成的具有荧光的化合物，即shill碱，可以用氯仿与甲醇的混合液作萃取剂，将其从组织中提取出来进行测定，测定shill碱的含量，可知道细胞被自由基损伤的程度，间接反映体内脂质过氧化水平。
1.3.3.3.2 仪器和试剂
仪器  荧光分光光度计、组织匀浆器、离心机、紫外灯、恒温水浴锅
试剂  氯仿（AR）
甲醇（AR）
氯仿－甲醇混合液（2：1 v/v）（新鲜配制）
0.1mol/L硫酸
硫酸奎宁标准液(0.1μg / mL 0.1mol/L 硫酸）
以上所用玻璃器皿均需经50％硝酸浸泡24h后，再经蒸馏水、双蒸水淋洗干燥。
1.3.3.3.3 实验步骤
取组织200mg，加入2:1(v/v)氯仿甲醇混合液4mL（w/v=1:20），用匀浆器在45℃水浴中2500r/min匀化1min，制成以氯仿甲醇混合液为介质的5％匀浆。随后加入4mL 蒸馏水，以2000r/min（匀浆器）充分混合1min，除去黄素干扰物，3000r/min离心10min后样品分为3层，上层为水相，中层为组织，下层为氯仿甲醇相。小心吸去水层，沿管壁穿过中层，将下层氯仿甲醇液取出，不可将水混入提取液中，若水混入提取液中，应再离心去除水。向氯仿甲醇提取液中加入甲醇0.2mL，轻轻振荡混匀，使之清澈透明，置紫外灯下照射30s，倒入石英杯中，测定荧光强度。
以硫酸奎宁（0.1μg/mL  0.1mol/L硫酸）为标准对照，在狭缝4.4，灵敏度3.6，激发波长360nm，发射波长450nm，其荧光强度为55－60U，在该条件下测定样品荧光强度。氯仿甲醇混合液为空白对照。
 
计算公式：
     
　　　       　　　　　样品荧光强度－空白荧光强度                 匀浆体积
脂褐质含量(μg/g组织)＝──────────────×硫酸奎宁浓度×────
　　　      　　　　　 硫酸奎宁荧光强度                 　　     样品重量
 
1.3.3.3.4 数据处理及结果判定
一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值< F0.05,结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。
受试样品组与模型（或老龄）对照组比较，脂褐质含量降低有统计学意义，判定该受试样品有降低脂质过氧化作用，实验结果阳性。
 
1.3.3.3.5 注意事项：
1.3.3.3.5.1 吸取氯仿层时要非常小心,以免带入组织颗粒和水，影响荧光测定。
1.3.3.3.5.2.荧光化合物的全部化学性质与特点不清楚，有些正常生化物质，如视黄醛和黄素类化合物也具有类似荧光产物的荧光光谱，黄素类物质是水溶性物质，水洗氯仿甲醇混合液，便可除去；视黄醛是脂溶性的，在氯仿中经紫外线照射后迅速降解，其它一些共轭多烯化合物，用紫外线照射也可除去。
1.3.3.3.5.3.丙二醛与自由氨基的交联反应较为缓慢，Schiff碱的形成是一个长时间的过程，不能立即反映自由基损伤反应的变化。因此，给予受试样品的时间要长，一般2－3个月，长者可达6个月以上。
 
1.3.4 抗氧化功能酶活力测定
1.3.4 抗氧化功能酶活力测定
SOD催化超氧阴离子自由基（O2.－）生成H2O2，再由其它抗氧化功能酶如谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)和过氧化氢酶作用生成水，这样可以清除O2.－对细胞的毒害作用。SOD、GSH-Px在动物某些器官和人体血红细胞中的含量均有明显的增龄变化,酶活性与生物年龄的增长成反比。消除自由基的能力与酶活性成正比。
1.3.4.1 血/组织中超氧化物歧化酶（SOD）活力测定
1.3.4.1.1 原理
O2.－氧化羟基的最终产物为亚硝酸盐，后者在对氨基苯磺酸及甲萘胺作用下呈现紫红色，在波长530nm处有极大吸收峰，可用分光光度法进行测定，当SOD消除O2.－ 后形成的亚硝酸盐减少。
 
1.3.4.1.2仪器与试剂
仪器  721分光光度计、离心机、恒温水浴、匀浆器
试剂 65mM磷酸盐缓冲液(PBS) pH7.8
10mmol/L盐酸羟胺
  盐酸羟胺6.95mg，加PBS至10mL
7.5mmol/L黄嘌呤
  黄嘌呤11.41mg，加0.1M NaOH 2.5mL溶解，加PBS至10mL
0.2mg/mL黄嘌呤氧化酶
  取10mg/mL黄嘌呤氧化酶0.2mL加冰冷PBS 9.8mL至10mL
0.1%甲萘胺
取0.2gα-甲萘胺溶于40mL沸蒸馏水，凉至室温加50mL冰醋酸，再加110mL凉蒸馏水至200mL
0.33%对氨基苯磺酸
取0.66g对氨基苯磺酸溶于150mL温蒸馏水，加50mL冰醋酸至200mL
SOD标准品
三氯甲烷
95％乙醇(v/v)
0.9%生理盐水
1.3.4.1.3 实验步骤
红细胞抽提液制备： 10μl全血冲入0.5mL生理盐水，2000r/min离心3min，弃上清，加冰冷的双蒸水0.2mL混匀，加入95％乙醇0.1mL，振荡30s，加入三氯甲烷0.1mL，置快速混合器抽提1min，4000r/min离心3min，分层，上层为SOD抽提液，中层为血红蛋白沉淀物，下层为三氯甲烷，记录上清液体积待测。
组织匀浆的制备：剪取一定量的所需脏器，生理盐水冲洗、拭干、称重、剪碎，至玻璃匀浆器中加入冷生理盐水20000r/min匀浆10s，间歇30s，反复进行三次，制成1％组织匀浆，（最好用超声波发生器处理30s），使线粒体振破，以中性红－詹钠氏绿B染色证明线粒体已振碎。以4000r/min离心5min，取上清液20μl待测。
SOD标准抑制曲线  将SOD标准品用磷酸盐缓冲液配制成750U/mL的溶液，再稀释到50倍，即SOD量为15U/mL（1.5μg/mL），用本法测定不同量的SOD标准液的百分抑制率，以百分抑制率为纵坐标，以SOD活力单位U/mL为横坐标绘制标准曲线。
                   对照管OD－测定管OD
SOD百分抑制率＝──────────────×100％
                     对照管OD
   
计算
每mL反应液中SOD抑制率达50％时所对应的SOD量为一个单位。
              (对照管OD-测定管OD)  ×100％
                对照管OD               　  反应液总量(6mL)
SOD活力(U/mL)＝────────────×─────────×样品稀释倍数
                        50％                     取液量
 
也可用酶比活法即以每管样品的百分抑制率从SOD标准曲线查出相应的SOD U/mL，乘以稀释倍数(1mL/取样量)。
    若样品为组织匀浆液，根据匀浆浓度或组织蛋白质含量，将单位换算为U/g组织或U/mg蛋白。若样品为红细胞抽提液，根据血红蛋白含量，可换算为U/g Hb。
 
样品测定步骤：
试剂 测定管 对照管
1/15mol/L磷酸盐缓冲液 pH7.8(mL) 1.0 1.0
样品 A* 
10mmol/L盐酸羟胺(mL) 0.1 0.1
7.5mmol/L黄嘌呤(mL) 0.2 0.2
0.2mg/mL黄嘌呤氧化酶(mL) 0.2 0.2
双蒸水(mL) 0.49 0.49
混匀，37℃恒温水浴30min
0.33%对氨基苯磺酸(mL) 2.0 2.0
0.1%甲萘胺(mL) 2.0 2.0
混匀15min后，倒入1cm光径比色杯，以蒸馏水调零，530nm处比色测定OD值。
 * A 所用样品的量
红细胞抽提液 10 μl
血清（或血浆） 20 μl(溶血样品剔除)
1%组织匀浆 10-40 μl
注：如用试剂盒，可按试剂盒的操作要求进行。
1.3.4.1.4 数据处理及结果判定
一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值< F0.05,结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。
受试样品组与模型（或老龄／正常）对照组比较，SOD活力升高有统计学意义，判定该受试样品有升高SOD作用，实验结果阳性。若受试样品组SOD升高接近空白（或少龄）对照组，两者统计差异无显著性，则说明该受试样品具有较强的升高SOD作用。
 
1.3.4.2 血/或组织中谷胱甘肽过氧化物酶（GSH－Px）活力测定
1.3.4.2.1 原理
    谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）是体内存在的一种含硒清除自由基和抑制自由基反应的系统。对防止体内自由基引起膜脂质过氧化特别重要，其活力以催化GSH氧化的反应速度，及单位时间内GSH减少的量来表示，GSH和5,5’-二硫对硝基苯甲酸（DTNB）反应在GSH-Px催化下可生成黄色的5-硫代2-硝基苯甲酸阴离子，于423nm波长有最大吸收峰，测定该离子浓度，即可计算出GSH减少的量，由于GSH能进行非酶反应氧化，所以最后计算酶活力时，必须扣除非酶反应所引起的GSH减少。
1.3.4.2.2 试剂和仪器
仪器  721分光光度计、低温高速离心机、匀浆器、恒温水浴锅、微量加样器
试剂  叠氮钠磷酸缓冲液 pH7.0
NaN3 16.25mg 终浓度2.5mmol/L
EDTA-Na2 7.44mg 终浓度0.2mmol/L
Na2HPO4 1.732g 终浓度0.2mol/L
NaH2PO4 1.076g 终浓度0.2mol/L
加蒸馏水至100mL，用少量HCL、NaOH调pH7.0，4℃保存。
1mmol/L谷胱甘肽（还原型GSH）溶液
GSH 30.7mg加叠氮钠磷酸缓冲液至100mL，临用前配制，冰冻保存1－2日。
1.25-1.5mmol/LH2O2溶液
取30％H2O2 0.15-0.17mL，用双蒸水稀释至100mL，作为贮备液，4℃避光保存，临用前将贮备液用双蒸水稀释10倍即可。
偏磷酸沉淀液
HPO3 16.7g（先用蒸馏水溶解）
EDTA 0.5g
NaCl 280g
加蒸馏水至1000mL，用普通滤纸过滤，室温保存。
0.32mol/LNa2HPO4溶液:
Na2HPO4  22.7g加蒸馏水至500mL，室温保存。
DTNB显色液
DTNB 40mg
柠檬酸三钠 1.0g
加蒸馏水至100mL，4℃避光保存1个月。
           0.2M磷酸缓冲液PH7.4
           0.9%生理盐水
1.3.4.2.3 实验步骤
1.3.4.2.3.1 样品制备
　　血样稀释液：取鼠血10μl加入到1mL双蒸水中，充分振摇，使之全部溶血1:100待测，4h内测定酶活力。若当天来不及测定，将肝素抗凝全血置-20℃冻存，3d内测定，若4℃存放，28h内必须测完。测前取出样品室温自然解冻，
　　组织上清液：动物禁食过夜，处死后，立即取出所需脏器，放入冷生理盐水中洗去浮血，剔除脂肪及结缔组织，滤纸吸干后，在冰浴上剪成碎块，称取适量组织，加冷0.2M磷酸缓冲液，以20000r/min匀浆10s，间歇30s，反复3次制成5%组织匀浆，操作在冰浴中进行，匀浆以12500×g离心10min（低温高速离心机），以沉淀为破碎的细胞、细胞碎片、核及线粒体，上清液用以测胞液中的酶活力，最好当天测，否则加20％(v/v)甘油分装于塑料管，放置-20～-80℃，可保存数周，而酶活力不减。
1.3.4.2.3.2 GSH标准曲线的制作：
　　取1.0mmol/LGSH溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分别置于10mL小容器瓶中，各加入偏磷酸沉淀剂8mL，用双蒸水稀释至10mL刻度，即得到浓度为0、20、40、60、80、100μmol/L的 GSH标准液。
　　取上述不同浓度标准液各2mL，放入试管中，加入0.32mol/L Na2HPO4 2.5mL，比色前加入DTNB显色液0.5mL用光径1cm杯，5min内在可见光423nm波长测OD值，以双蒸水调零点。
　　以GSH含量（μmol/L）为横坐标，OD423值为纵坐标，绘制标准曲线。

上一页  [1] [2] [3] 下一页