1.3.4.2.3.3 测定步骤：
 
试剂 样品管(mL) 非酶管(mL) 空白管(mL)
1.0mmol/LGSH 0.4 0.4 
样品** 0.4   
双蒸水*   0.4 
37℃水浴预温5min
H2O2(37℃预热) 0.2 0.2 
37℃水浴准确反应3min (严格控制时间)
偏磷酸沉淀液 4 4 
3000r/min离心10min
离心上清液 2 2 
双蒸水     0.4
偏磷酸沉淀液     1.6
0.32mol/LNa2HPO4 2.5 2.5 2.5
DTNB显色液 0.5 0.5 0.5
显色反应1min后于423nm波长（1cm光径），读OD值，5min之内读数准确。
* 样品为组织上清液时，非酶管改为加热使酶失活的组织上清液。
**血样稀释液     0.1-0.4mL
  组织上清液     1:20稀释，取稀释液0.4mL
 
1.3.4.2.3.4 计算
　　鼠全血GSH-Px活力单位  规定每1mL全血，每分钟，扣除非酶反应的log[GSH]降低后，使log[GSH]降低1为一个酶活力单位。
                                   非酶管log[GSH]-样品管log[GSH]
鼠全血GSH-Px活力单位(U/mL全血)= ─────────────────
                                         3min×0.004mL
                         log[非酶管OD－空白管OD]-log[样品管OD-空白管OD]
                       = ────────────────────────
                                        3min×0.004mL
 
　　组织GSH-Px比活力单位  规定每毫克蛋白质，每分钟，扣除非酶反应，使GSH浓度降低1μmol/L为一个酶活力单位。
                                        (非酶管OD－样品管OD]×A**×5
组织GSH-Px比活力单位(U/mg蛋白) = ───────────────────
                                          3min×样品蛋白质的mg数 *
    *  Folin法或双缩脲法测样品蛋白质含量
 
           标准GSH浓度(μmol/L)
    ** A=───────────  即标准曲线斜率。
          标准GSH光密度(OD)
 
1.3.4.2.4 数据处理及结果判定
　　一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值< F0.05,结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。
受试样品组与模型（或老龄／正常）对照组比较，GSH-Px活力升高有统计学意义，判定该受试样品有升高GSH-Px作用，实验结果阳性。
 
1.3.4.2.5 注意事项
1.3.4.2.5.1 由于H2O2易分解导致浓度改变，临用时取贮备液用分光光度计测其浓度，取贮备液3mL，测定1cm光径的240nm处OD值。
                 OD
浓度(mmol/L)＝─────────
                0.036(消光系数)
若OD值为0.45，则表明H2O2浓度为12.5mmol/L。
 
1.3.4.2.5.2  5-硫代2-硝基苯甲酸阴离子的显色不仅与整个反应体系中氢离子浓度有关，还受反应时间限制。加入显色剂后，反应体系pH为6.5时，11min开始显色，此时比色5min内读数准确。
1.4．数据处理与结果判定
　　一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值< F0.05,结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。
受试样品组与模型（或老龄）对照组比较，过氧化脂质含量降低有统计学意义，判定该受试样品有降低脂质过氧化作用，实验结果阳性。
受试样品组与模型（或老龄／正常）对照组比较，抗氧化功能酶活力升高有统计学意义，判定该受试样品有升高抗氧化功能酶活力作用，实验结果阳性。
 
结果判定
过氧化脂质含量中任一指标和抗氧化功能酶活性中任一指标均为阳性，可判定该受试样品抗氧化功能动物实验结果阳性。
 
    2 人体试食试验
2.1 受试者纳入标准
选年龄在45－65岁，身体健康状况良好，无明显脑、心、肝、肺、肾、血液疾患，无长期服药史，志愿受试保证配合的人群。
2.2 排除受试者标准 
2.2.1妊娠或哺乳期妇女，对保健食品过敏者。
2.2.2合并有心、肝、肾和造血系统等严重疾病患者。
2.2.3短期内服用与受试功能有关的物品，影响到对结果的判断者。
2.2.4不符合纳入标准，未按规定食用受试样品，无法判定功效或资料不全影响功效或安全性判断者。
2.3 受试者分组
对受试者按MDA、SOD、GSH-Px水平随机分为试食组和对照组，尽可能考虑影响结果的主要因素如年龄、性别、生活饮食习惯等，进行均衡性检验，以保证组间的可比性。每组受试者不少于50例。
2.4 试验方法
采用自身和组间两种对照设计。试验组按推荐服用方法、服用量每日服用受试产品，对照组可服用安慰剂或采用阴性对照。受试样品给予时间3个月，必要时可延长至6个月。试验期间对照组和试食组原生活、饮食不变。
2.5 观察指标
　　各项指标在试验开始及结束时各检测1次。
2.5.1 安全性指标
2.5.1.1 一般状况  包括精神、睡眠、饮食、大小便、血压等
2.5.1.2 血、尿、便常规检查
2.5.1.3 肝、肾功能检查
2.5.1.4 胸透、心电图、腹部B超检查
2.5.2功效指标
2.5.2.1 过氧化脂质含量  观察试验前后MDA的变化及MDA下降百分率。 (测定方法见1.3.3.1)
      
 
                  试验前MDA-试验后MDA
MDA下降百分率=--------------------×100%
                      试验前MDA
 
2.5.2.2 超氧化物歧化酶  观察试验前后SOD的变化及SOD升高百分率。(测定方法见1.3.4.1)
               试验前SOD-试验后SOD
SOD升高百分率=--------------------×100%
                      试验前SOD      
 
2.5.2.3 谷胱甘肽过氧化物酶  观察试验前后GSH－PX的变化及GSH－PX升高百分率。(测定方法见附1)
                试验前GSH－PX-试验后GSH－PX
GSH－PX升高百分率=-------------------------×100%
                          试验前GSH－PX 
 
2.6数据处理和结果判定
凡自身对照资料可以采用配对t检验，两组均数比较采用成组t检验，后者需进行方差齐性检验，对非正态分布或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态方差齐后，用转换的数据进行t检验；若转换数据仍不能满足正态方差齐要求，改用t’检验或秩和检验；但变异系数太大（如CV>50％）的资料应用秩和检验。在试验前组间比较差异无显著性的前提下，可进行试验后组间比较。
各功效观察指标试验前后自身比较和试食后组间比较均有统计学意义，方可判定该指标阳性。
过氧化脂质含量、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶三项实验中任一项实验结果阳性，可判定该受试样品具有抗氧化功能作用。
 
[附1] 血中谷胱甘肽过氧化物酶（GSH－Px）活力测定
1 原理
　　谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）是体内存在的一种含硒清除自由基和抑制自由基反应的系统。对防止体内自由基引起膜脂质过氧化特别重要，其活力以催化GSH氧化的反应速度，及单位时间内GSH减少的量来表示，GSH和5,5’-二硫对硝基苯甲酸（DTNB）反应在GSH-Px催化下可生成黄色的5-硫代2-硝基苯甲酸阴离子，于423nm波长有最大吸收峰，测定该离子浓度，即可计算出GSH减少的量，由于GSH能进行非酶反应氧化，所以最后计算酶活力时，必须扣除非酶反应所引起的GSH减少。
2 试剂和仪器
仪器  721分光光度计、恒温水浴锅、微量加样器、离心机
试剂  叠氮钠磷酸缓冲液 pH7.0
NaN3 16.25mg 终浓度2.5mmol/L
EDTA-Na2 7.44mg 终浓度0.2mmol/L
Na2HPO4 1.732g 终浓度0.2mol/L
NaH2PO4 1.076g 终浓度0.2mol/L
加蒸馏水至100mL，用少量HCL、NaOH调pH7.0，4℃保存。
1mmol/L谷胱甘肽（还原型GSH）溶液
GSH 30.7mg加叠氮钠磷酸缓冲液至100mL，临用前配制，冰冻保存1－2日。
1.25-1.5mmol/L  H2O2溶液
取30％H2O2 0.15-0.17mL，用双蒸水稀释至100mL，作为贮备液，4℃避光保存，临用前将贮备液用双蒸水稀释10倍即可。
偏磷酸沉淀液
HPO3 16.7g（先用蒸馏水溶解）
EDTA 0.5g
NaCl 280g
加蒸馏水至1000mL，用普通滤纸过滤，室温保存。
0.32mol/L Na2HPO4溶液:
Na2HPO4  22.7g加蒸馏水至500mL，室温保存。
DTNB显色液
DTNB 40mg
柠檬酸三钠 1.0g
加蒸馏水至100mL，4℃避光保存1个月。
 
    3 实验步骤
3.1 样品制备
　　血样稀释液  取血20μl加入到1mL 双蒸水中，充分振摇，使之全部溶血1:100待测，4h内测定酶活力。若当天来不及测定，将肝素抗凝全血置-20℃冻存，3d内测定，若4℃存放，28h内必须测完。测前取出样品室温自然解冻，
3.2  GSH标准曲线的制作：
　　取1.0mmol/L GSH溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分别置于10mL小容器瓶中，各加入偏磷酸沉淀剂8mL，用双蒸水稀释至10mL刻度，即得到浓度为0、20、40、60、80、100μmol/L的 GSH标准液。
　　取上述不同浓度标准液各2mL，放入试管中，加入0.32mol/L Na2HPO4 2.5mL，比色前加入DTNB显色液0.5mL用光径1cm杯，5min内在可见光423nm波长测OD值，以双蒸水调零点。
　　以GSH含量（μmol/L）为横坐标，OD423值为纵坐标，绘制标准曲线。
3.3 测定步骤：
试剂 样品管(mL) 非酶管(mL) 
1.0mmol/L GSH 0.4 0.4 
血样稀释液 0.4   
双蒸水 *   0.4 
37℃水浴预温5min
H2O2(37℃预热) 0.2 0.2 
37℃水浴准确反应5min(严格控制时间)
偏磷酸沉淀液 4 4 
3000r/min离心10min
离心上清液 2 2 
双蒸水     
偏磷酸沉淀液     
0.32mol/L  Na2HPO4 2.5 2.5 
DTNB显色液 0.5 0.5 
显色反应1min后于423nm波长（1cm光径），读OD值，5min之内读数准确。
 
3.4 计算
　　全血GSH-Px活力单位  规定每8μl全血，在37℃反应5min，扣除非酶反应后，使GSH浓度降低1μmol/L浓度为一个酶活力单位。
　　全血GSH-Px活力U/mL血=（非酶管OD-样品管OD）×A*×5**
      　标准GSH浓度（μmol/L）
* A＝──────────── 即标准曲线的斜率
      标准GSH光密度（OD）
** 5 换算成1mL反应液中GSH浓度时，需乘以稀释倍数5
 
3.5 注意事项
3.5.1 由于H2O2易分解导致浓度改变，临用时取贮备液用分光光度计测其浓度，取贮备液3mL，测定1cm光径的240nm处OD值。
                    OD
浓度(mmol/L)＝─────────
                 0.036(消光系数)
若OD值为0.45，则表明H2O2浓度为12.5mmol/L。
 
3.5.2 5-硫代2-硝基苯甲酸阴离子的显色不仅与整个反应体系中氢离子浓度有关，还受反应时间限制。加入显色剂后，反应体系pH为6.5时，11min开始显色，此时比色5min内读数准确。

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