增加骨密度功能作用检验方法根据受试样品作用原理的不同，分为方案一（补钙为主的受试物）和方案二（不含钙或不以补钙为主的受试物）两种。

    1 方案一
1.1 实验原理
机体中的钙绝大部分储存于骨骼及牙齿中，动物若摄入钙量不足会影响机体和骨骼的生长发育，表现为体重，身长，骨长，骨重，骨钙含量及骨密度低于摄食足量钙的正常大鼠。生长期大鼠在摄食低钙饲料的基础上分别补充碳酸钙（对照组）或受试含钙产品（实验组），比较两者在促进机体及骨骼的生长发育，增加骨矿物质含量和增加骨密度功能上的作用，从而对受试样品增加骨密度功能的功能进行评价。
1.2 仪器和试剂
1.2.1 仪器：原子吸收分光光度计、骨密度仪（单光子骨密度仪或双能X线骨密度仪或相关仪器）、精密卡尺、动物解剖器械、动物天平、105℃烘箱
1.2.2 硝酸，优级纯
高氯酸，优级纯
氧化镧，2％氧化镧溶液 称取分析纯氧化镧（含量大于99.99%）25  克，加75mL优级纯盐酸，加去离子水至1000mL。
 钙标准溶液 称取1.2486克分析纯碳酸钙（纯度大于99.99％），加50mL去离子水，加盐酸使之溶解。移入1000mL容量瓶中，加2％氧化镧溶液至刻度。此溶液1.00mL相当于500mg钙。储于聚乙烯瓶中，40C保存，临用时稀释。
1.3 实验方法
1.3.1 实验动物
出生4周左右的断乳大鼠,体重约60－75克，同一性别，每组8－12只。
1.3.2 基础饲料：用此基础饲料配制低钙对照组以及各剂量组。
基础饲料配方（Ca2+计，调整Ca2+为150mg/100g饲料）：
成分 ％
酪蛋白 10.0
黄豆粉 15.0
小麦面粉 54.0
玉米油或花生油 4.0
纤维素 2.0
混合盐‚ 2.6
混合维生素ƒ 1.0
氯化胆碱 0.2
d1－蛋氨酸 0.2
淀粉„ 11.0
 
需高压处理后用
‚混合盐：每kg混合盐中各组份含量：KH2PO4，501.4g；NaCl，74.0g；MgCO3，50.2g；乳酸亚铁，5.4g；乳酸锌，4.16g；MnCO3，3.5g；CuSO4•5H2O，0.605g；Na2SeO3，6.6mg；KI，7.76mg；Cr3Cl•6H2O，0.292g；加蔗糖到1Kg。
ƒ混合维生素：每Kg混合维生素中各组份含量：维生素A，400，000IU；维生素D3，100，000IU；维生素E，500IU；维生素K，5mg；维生素B1,600mg；维生素B2，600mg；维生素B6，700mg；维生素B12，1mg；尼克酸， 3g；叶酸，200mg；泛酸钙，1.6g；生物素，20mg；加蔗糖到1Kg。
„可根据各组待测受试物（或碳酸钙）的需用量调节淀粉用量
 
1.3.3剂量分组及受试样品给予时间
实验设三个剂量组，以人体推荐量的5倍为其中的一个剂量组，另设二个剂量组，同时设一个低钙对照组(150mg/100g饲料)和与相应剂量受试物钙水平相同的碳酸钙对照组（如仅设一个碳酸钙对照组，推荐设立与高剂量钙水平相同的碳酸钙对照组）。用低钙对照组(150mg/100g饲料)饲料配制受试样品各剂量组和碳酸钙对照组。受试样品给予时间3个月。
1.3.4 受试物给予途径
经口灌胃给予受试物，无法灌胃时将受试物掺入饲料，并记录每只动物的饲料摄入量。
1.3.5.实验步骤
出生4周的断乳大鼠经适应期一周后，禁食12 小时，称体重，按体重随机分组，分笼饲养。饮用去离子水以避免从饮水中获得钙。
1.4 观察指标
1.4.1 体重测定：
禁食12小时后，测定体重。每周一次。
1.4.2 股骨重量测定:
动物喂养3个月后处死，剥离出右侧股骨，于105℃烤箱中烤至恒重，称量骨干重。
1.4.3 股骨骨密度测定:
用骨密度仪，（单光子骨密度仪或双能X线骨密度仪或其它相关仪器）测量股骨中点及股骨远心端的骨密度。
1.4.3.1 在股骨远心端及股骨中点画出标记以确定测量点。
   股骨中点测量点的确定：测量股骨全长，通过其中点，沿横截面方向画一直线,此为股骨中点测量点（截面）。
股骨远心端测量点的确定：于股骨远心端关节凹槽最下缘处确定测量点，通过此点，画一与上述股骨中点处标记平行的直线，此为股骨远心端测量点（截面）。
1.4.3.2 测量前用骨模型对仪器进行校准。
1.4.3.3 经校准可以使用后，继续测定骨模型并与其标准值进行比较，误差不得超过3％。
1.4.3.4. 单光子骨密度仪或双能X线骨密度仪参数设定：测定方式：精密
扫描次数：2次
扫描方式：自动
探测域值：99％
1.4.3.5 测量股骨中点及股骨远心端骨密度。
将待测骨放置于测量台上与骨密度仪探测头移动方向垂直；移动待测骨，令其待测点标记线与探测头移动轨迹于测量台上的垂直投影重合。开始测量，每点应重复测定两次，如两次结果不平行（误差大于10%），应当重新测量。将两次结果取平均值，以BW（骨宽）除BMC（骨矿物质含量），其结果即为BMD（骨密度）。 
1.4.4 骨钙含量及饲料含钙量测定：
用原子吸收法测量。
1.4.4.1 样品采集与制备   
1.4.4.1.1  饲料样品经均匀混合并过20目筛，在烘箱中烘干，置干燥器中冷却后称重，磨细。注意防止在样品制备过程中的污染。
1.4.4.1.2  取大鼠一侧股骨在105℃烘箱中烘干至恒重后，置于三角瓶中进行消化。
1.4.4.2 样品消化   
根据样品中钙的含量，准确称取0.300~1.00克，置于150mL三角瓶 中，上盖小漏斗，加入混合酸（硝酸：高氯酸=4：1）15~20mL，在电热板上加热消化直至冒白烟并透明无色。酸液不够时可以再加入少量混合酸。消化液透明无色后加数毫升去离子水，煮沸以赶除剩余的酸，重复两次，最后消化液的体积不超过1mL。
消化样品时应同时作空白试验，加入与样品消化时相同体积的混合酸，在相同条件下消化。
1.4.4.3 测定   
按照原子吸收分光光度计仪器说明书的步骤进行。测定液、标准溶液和空白均用0.5%氧化镧溶液稀释，定容。
1.5 数据处理及结果判定
实验数据采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值< F0.05,结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。
 
结果判定
骨钙含量或骨密度显著高于低钙对照组且不低于相同剂量碳酸钙对照组，钙的吸收率不低于碳酸钙对照组，可判定受试物具有增加骨密度功能的作用。

    2 方案二
2.1 实验原理
雌性成年大鼠切除卵巢后，骨代谢增强，并发生骨重吸收（破骨）作用大于骨生成（成骨）作用的变化。这种变化表现为骨量丢失，经过一定时间的积累，可以造成骨密度降低模型。在建立模型的同时或模型建立之后给模型实验组大鼠补充受试样品，通过受试物抑制破骨或促进成骨等骨代谢调节作用，观察其在增加骨密度功能及骨钙含量的效果，从而对受试样品增加骨密度功能的功能进行评价。
2.2 实验动物
Wistar或SD雌性大鼠，300克左右，实验前适应1周。
2.3 饲料配方
     参照AIN93饲料配方配制半成品饲料，用适当的物质替换饲料中来源于大豆的成分，以避免大豆异黄酮等植物雌激素对实验结果的干扰。参考配方见下表。
参考饲料配方
成分 含量（%）
酪蛋白 23
DL-蛋氨酸 0.3
玉米淀粉 32
蔗糖 30
纤维 5
玉米油 5
混合矿物盐1 3.5
混合维生素2 1
二酒石酸胆碱 0.2
1  含有（mg/kg饲料）： MnSO4 110，CuSO4 0.8，FeSO4 1.2，KI 18.0，ZnSO4 2,960，CaHPO4 2,890，MgSO4 1.25×104。
2 含有（/kg饲料）： VitA 1.4×104IU，VitD 1,500 IU，VitE 120mg，VitK 3mg，VitB1 12mg，VitB2 20mg，VitB6 12mg，VitB12 0.03mg，烟酸 60mg，泛酸 24mg，叶酸 6mg，生物素 0.54mg。
2.4 仪器和试剂
2.4.1 仪器：原子吸收分光光度计、单光子骨密度仪或双能X线骨密度仪、精密卡尺、动物解剖器械、动物天平、105℃烘箱
2.4.2 试剂
硝酸，优级纯
高氯酸，优级纯
氧化镧，2％氧化镧溶液 称取分析纯氧化镧（含量大于99.99%）25  克，加75mL优级纯盐酸，加去离子水至1000mL。
钙标准溶液  称取1.2486克分析纯碳酸钙（纯度大于99.99％），加50mL去离子水，加盐酸使之溶解。移入1000mL容量瓶中，加2％氧化镧溶液至刻度。此溶液1.00mL相当于500mg钙。储于聚乙烯瓶中，40C保存，临用时稀释。

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