1. 实验动物
    推荐用近交系小鼠，如C57BL/6J、BALB/C等，6－8周龄，18－22g，雌雄均可，数量为单一性别，每组10－15只。

    2. 剂量分组及受试样品给予时间
实验设三个剂量组和一个空白对照组，以人体推荐量的10倍为其中的一个剂量组，另设二各剂量组，必要时设阳性对照组。受试样品给予时间30天，必要时可延长至45天，免疫模型动物实验可适当延长。

    3. 实验方法
3.1 ConA 诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验
    可任选下列方法之一
3.1.1 MTT法
3.1.1.1 原理
    当T淋巴细胞受ConA刺激后发生母细胞转化，活细胞特别是增殖细胞通过线粒体水解酶将 MTT（一种淡黄色的唑氮盐）分解为兰紫色结晶而显色，其光密度值能反映细胞的增殖情况。
3.1.1.2 仪器和材料
    RPMI1640 细胞培养液、小牛血清、2-巯基乙醇（2-ME）、青霉素、链霉素、刀豆蛋白A（ConA）、盐酸、异丙醇、MTT、Hank's液、PBS缓冲液（pH7.2-7.4）
    200目筛网、24孔培养板，96孔培养板（平底），手术器械、二氧化碳培养箱、酶标仪、721分光光度计、超净工作台
3.1.1.3 实验步骤
3.1.1.3.1 试剂配制
完全培养液  RPMI1640培养液过滤除菌，用前加入10％小牛血清，1％谷氨酰胺（200mmol/L），青霉素（100U/mL），链霉素（100ug/L）及5×10－5mol/L的2-巯基乙醇，用无菌的1mol/L的HCl或1mol/L的NaOH调pH至7.0-7.2，即完全培养液。
ConA液  用双蒸水配制成100ug/mL的溶液，过滤除菌，在低温冰箱（-20℃）保存。
无菌Hank's液  用前以3.5％的无菌NaHCO3调pH7.2-7.4。
MTT液  将5mgMTT溶于1mL pH7.2的PBS中，现配现用。
酸性异丙醇溶液  96mL 异丙醇中加入4mL 1mol/L的HCl，临用前配制。
3.1.1.3.2 脾细胞悬液制备
无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank's液平皿中，用镊子轻轻将脾磨碎，制成单个细胞悬液。经200目筛网过滤，或用4层纱布将脾磨碎，用Hank's液洗2次，每次离心10min（1000r/min）。然后将细胞悬浮于1mL的完全培养液中，用台酚兰染色计数活细胞数（应在95%以上），调整细胞浓度为3×106个/mL。
3.1.1.3.3 淋巴细胞增殖反应
将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1mL，一孔加75μL ConA 液（相当于7.5ug/mL），另一孔作为对照，置5％CO2，37℃CO2孵箱中培养72h。培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液0.7mL，加入0.7mL不含小牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT（5mg/mL）50μL /孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1mL酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板中，每个孔分装3～6孔作为平行样，用酶联免疫检测仪，以570nm波长测定光密度值。也可将溶解液直接移入2mL比色杯中，721分光光度计上在波长570nm测定OD值。
3.1.1.4 数据处理及结果判定
一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值< F0.05,结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。
用加ConA孔的光密度值减去不加ConA孔的光密度值代表淋巴细胞的增殖能力，受试样品组的光密度差值显著高于对照组的光密度差值，可判定该项实验结果阳性。
3.1.1.5 注意事项
选择有丝分裂原时ConA的浓度很重要，ConA的浓度过高会产生抑制作用，不同批号的ConA在实验前要预试，以找到最佳刺激分裂浓度。
 
3.1.2 同位素掺入法
3.1.2.1 原理
淋巴细胞在有丝分裂原PHA、ConA 等的刺激下，产生增殖反应，DNA和RNA合成明显增加，如在培养液中加入3H－胸腺嘧啶核苷（3H-TdR），则可被转化中的细胞摄入。测定标记淋巴细胞的放射强度可反映淋巴细胞增殖的程度。
3.1.2.2 仪器和材料
    RPMI-1640 细胞培养液、小牛血清、2-巯基乙醇（2-ME）、青霉素、链霉素、刀豆蛋白A（ConA）、Hank's液、PBS缓冲液（pH7.2-7.4）、3H-TdR、闪烁液[2,5-二苯基恶唑（PPO）0.5g、1,4-双-(5-苯基 恶唑基)-苯（POPOP）0.25g、二甲苯500mL混匀]
    200目筛网，96孔培养板（平底），手术器械、二氧化碳培养箱、超净工作台、液体闪烁仪、多头细胞取集器、49型玻璃纤维滤纸。
3.1.2.3 实验步骤
3.1.2.3.1 脾细胞悬液制备
无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank's液的小平皿中，用镊子轻轻将脾撕碎，制成单细胞悬液。经200目筛网过滤，用Hank's液洗3次，每次离心10min（1000r/min）。然后将细胞悬浮于2mL的完全培养液中，用台酚兰染色计数活细胞数（应在95%以上），最后用RPMI1640完全培养液将细胞数调成5×106个/mL。
3.1.2.3.2 淋巴细胞增殖反应:
    将脾细胞悬液加入到96孔培养板中，200μL/孔，每一份脾细胞悬液分装6个孔，3孔加ConA(5ug/mL)，另3个孔不加ConA 作为对照。置5％ CO2，37℃培养72h，培养结束前6h，每孔加入3H-TdR 20μL，使其终浓度为(3.7-18.5)×104Bq/mL。用多头细胞收集器将细胞取集于玻璃纤维滤纸上。滤纸片充分干燥后置测量瓶中，加入7mL闪烁液，用液闪仪测定每分钟脉冲数（cpm）。
3.1.2.4 数据处理及结果判定
一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值< F0.05,结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。
以每分钟脉冲数（cpm）表示增殖程度，用刺激指数（SI）来表示
      实验孔cpm
SI=─────────
      对照孔cpm
    受试样品组的SI值显著高于对照组的SI值，即可判定该项实验结果阳性。
 3.2 迟发型变态反应（DTH）
    可任选下列方法之一
3.2.1 二硝基氟苯诱导小鼠DTH（耳肿胀法）
3.2.1.1 原理
    二硝基氟苯（DNFB）是一种半抗原，将其稀释液涂抹腹壁皮肤后，与皮肤蛋白结合成完全抗原，由此刺激 T 淋巴细胞增殖成致敏淋巴细胞。4～7天 后再将其涂抹于耳部，使局部产生迟发型变态反应。一般在抗原攻击后24～48h达高峰，故于此时测定其肿胀程度。
3.2.1.2 材料
    DNFB、丙酮、麻油、硫化钡、打孔器。
3.2.1.3 实验步骤
3.2.1.3.1 试剂配制  DNFB溶液  DNFB溶液应新鲜配制，称取DNFB50mg，置清洁干燥小瓶中，将预先配好的5mL丙酮麻油溶液（丙酮：麻油=1：1），倒入小瓶，盖好瓶塞并用胶布密封。混匀后，用250μL注射器通过瓶盖取用。
3.2.1.3.2 致敏  每鼠腹部皮肤用硫化钡脱毛，范围约 3cm×3cm、用 DNFB 溶液50μL均匀涂抹致敏。
3.2.1.3.3 DTH的产生与测定  5天 后，用 DNFB 溶液 10μL 均匀涂抹于小鼠右耳（两面）进行攻击。攻击后 24h 颈椎脱臼处死小鼠，剪下左右耳壳。用打孔器取下直径8mm的耳片，称重。
3.2.1.4 数据处理与结果判定
一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值< F0.05,结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。
左右耳重量之差表示DTH的程度。受试样品组的差值显著高于与对照组的差值，可判定该项实验结果阳性。
3.2.1.5 注意事项
    操作时应避免DNFB与皮肤接触。
3.2.2 绵羊红细胞（SRBC）诱导小鼠DTH（足跖增厚法）
3.2.2.1 原理
    SRBC可刺激T淋巴细胞增殖成致敏淋巴细胞，4天后，当再以SRBC攻击时，即可见攻击部位出现迟发型变态反应。
3.2.2.2 材料
    游标卡尺（精密度0.02mm）、SRBC、微量注射器（50μL）。
3.2.2.3 实验步骤
3.2.2.3.1  致敏  小鼠用2％(v/v)SRBC腹腔或静脉免疫，每只鼠注射0.2mL（约1×108个SRBC）。
3.2.2.3.2  DTH的产生与测定  免疫后4天，测量左后足跖部厚度，然后在测量部位皮下注射20％(v/v)SRBC，每只鼠20μL（约1×108个SRBC），注射后于24h测量左后足跖部厚度，同一部位测量三次，取平均值。
3.2.2.4 数据处理和结果判定
一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值< F0.05,结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。
以攻击前后足跖厚度的差值来表示DTH 的程度。受试样品组的差值显著高于对照组的差值，可判定该项实验结果阳性。
3.2.2.5 注意事项
    测量足跖厚度时，最好由专人来进行。卡尺紧贴足跖部，但不要加压，否则会影响测量结果。
    攻击时所用的SRBC要新鲜（保存期不超过1周）。
3.3 抗体生成细胞检测（Jerne改良玻片法）
3.3.1 原理
    用绵羊红细胞（SRBC）免疫的小鼠脾细胞悬液与一定量的SRBC混合，在补体参与下，使抗体分泌细胞周围的SRBC溶解，形成肉眼可见的空斑。溶血空斑数大体可反映抗体分泌细胞数。
3.3.2 仪器和材料
    二氧化碳培养箱、恒温水浴、离心机、手术器械、玻片架、200目筛网、SRBC、补体（豚鼠血清）、Hank's液、RPMI1640培养液、SA缓冲液、琼脂糖。
3.3.3 实验步骤
3.3.3.1  SRBC  绵羊颈静脉取血，将羊血放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中，朝一个方向摇动，以脱纤维，放入4℃冰箱保存备用，可保存2周。
3.3.3.2 制备补体  采集豚鼠血，分离出血清（至少5只豚鼠的混合血清），将1mL压积SRBC加入到5mL豚鼠血清中， 4℃冰箱放置30min，经常振荡，离心取上清，分装，－70℃保存。用时以SA液按1∶8－15稀释。
3.3.3.3 玻片涂膜  在清洁玻片上刷上一薄层琼脂糖（0.5g琼脂糖加双蒸水至100mL，加热溶解），待干后放片盒可长期保存备用。
3.3.3.4 免疫动物  取羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心（2000r/min）10min，计数细胞，每只鼠经腹腔或静脉注射SRBC  5×107～2×108个。也可将压积SRBC 用生理盐水配成2%（v/v）的细胞悬液，每只鼠腹腔注射0.2mL。
3.3.3.5 脾细胞悬液制备
    将SRBC免疫4～5天后的小鼠颈椎脱臼处死，取出脾脏，放在盛有Hank's液的小平皿内，轻轻撕碎脾脏，制成细胞悬液，经200目筛网过滤，或用4层纱布将脾磨碎，离心（1000/min）10min，用Hank's液洗2遍，最后将细胞悬浮在5mL RPMI1640培养液中，计数细胞，并将细胞浓度调整为5x106个/mL。也可将细胞悬浮在8mLHank's液，测定脾空斑形成数。
3.3.3.6 空斑的测定
    将表层培养基（1g琼脂糖加双蒸水至100mL）加热溶解后，放45℃水浴保温，与等量pH7.2～7.4、2倍浓度的Hank's液混合，分装小试管，每管0.5mL，再向管内加50μL 10% SRBC(v/v，用SA液配制)，20μL脾细胞悬液（5×106个/mL）或25μL脾细胞悬液，迅速混匀，倾倒于已刷琼脂糖薄层的玻片上，做平行片，待琼脂凝固后，将玻片水平扣放在片架上，放入二氧化碳培养箱中温育1～1.5h，然后用SA缓冲液稀释的补体（1：8）加入到玻片架凹槽内，继续温育1～1.5h后，计数溶血空斑数。
3.3.4 数据处理及结果判定
一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值< F0.05,结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。
用空斑数/106脾细胞或空斑数/全脾细胞来表示，受试样品组的空斑数显著高于对照组的空斑数，可判定该项实验结果阳性。
 
3.4 血清溶血素的测定
    可任选下列方法之一。
3.4.1 血凝法
3.4.1.1 原理
    用SRBC免疫动物后，产生抗SRBC抗体（溶血素），利用其凝集SRBC的程度来检测溶血素的水平。
3.4.1.2 仪器和材料
    SRBC、生理盐水、微量血凝实验板、离心机
3.4.1.3 实验步骤
3.4.1.3.1  SRBC  绵羊颈静脉取血，将羊血放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中，朝一个方向摇动，以脱纤维，放入4℃冰箱保存备用，可保存2周。
3.4.1.3.2 免疫动物及血清分离  取羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心(2000r/min)10min。将压积SRBC用生理盐水配成2％（v/v）的细胞悬液，每只鼠腹腔注射0.2mL进行免疫。4～5天后，摘除眼球取血于离心管内，放置约1h，将凝固血与管壁剥离，使血清充分析出，2000r/min离心10min，收集血清。
3.4.1.3.3 凝集反应  用生理盐水将血清倍比稀释，将不同稀释度的血清分别置于微量血凝实验板内，每孔100μL ，再加入100μL 0.5％(v/v)的SRBC悬液，混匀，装入湿润的平盘内加盖，于37℃温箱孵育3h，观察血球凝集程度。
3.4.1.4 数据处理及结果判定
一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值< F0.05,结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。
血清凝集程度一般分为5级（0－Ⅳ）记录，按下式计算抗体积数，受试样品组的抗体积数显著高于对照组的抗体水平，可判定该项实验结果阳性。
抗体水平＝（S1+2S2+3S3……nSn）
式中1、2、3……n代表对倍稀释的指数，S代表凝集程度的级别，抗体积数越大，表示血清抗体越高。
0级  红细胞全部下沉，集中在孔底部形成致密的圆点状，四周液体清皙。
Ⅰ级  红细胞大部分沉集在孔底成园点状，四周有少量凝集的红细胞。
Ⅱ级  凝集的红细胞在孔底形成薄层，中心可以明显见到一个疏松的红点。
Ⅲ级  凝集的红细胞均匀地铺散在孔底成一薄层,中心隐约可见一个小红点。
Ⅳ级  凝集的红细胞均匀地铺散在孔底成一薄层，凝块有时成卷折状。
3.4.1.5 注意事项
    血清稀释时要充分混匀。最后一个稀释度应不出现凝集现象。
3.4.2 半数溶血值（HC50）的测定
3.4.2.1 原理
    用SRBC免疫动物后，产生抗SRBC抗体（溶血素），与SRBC一起孵育，在补体参与下，可发生溶血反应，释放血红蛋白，通过测定血红蛋白含量反映动物血清中溶血素的含量。
3.4.2.2 仪器和材料
    721分光光度计、离心机、恒温水浴、SRBC、补体（豚鼠血清）、SA缓冲液、都式试剂（碳酸氢钠1.0g、高铁氰化钾0.2g、氰化钾0.05g，加蒸馏水至1000mL）
3.4.2.3 实验步骤
3.4.2.3.1  SRBC  绵羊颈静脉取血，将羊血放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中朝一个方向摇动，以脱纤维，放入4℃冰箱保存备用，可保存2周。
3.4.2.3.2 制备补体  采集豚鼠血，分离出血清（至少5只豚鼠的混合血清），将1mL压积SRBC加入到5mL豚鼠血清中，放4℃冰箱30min，经常振荡，离心取上清，分装，－70℃保存。用时以SA液按1∶8稀释。
3.4.2.3.3 免疫动物及血清分离  取羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心(2000r/min)10min。将压积SRBC用生理盐水配成2％（v/v）的细胞悬液，，每只鼠腹腔注射0.2mL进行免疫。4～5天后，摘除眼球取血于离心管内，放置约1h，使血清充分析出，2000r/min离心10min，或6000r/min,4min,收集血清。
3.4.2.3.4 溶血反应  取血清用SA缓冲液稀释（一般为200～500倍）。将稀释后的血清1mL置试管内，依次加入10％(v/v)SRBC  0.5mL，补体1mL（用SA液按1:8稀释）。另设不加血清的对照管（以SA液代替）。置37℃恒温水浴中保温15～30min后，冰浴终止反应。2000r/min离心10min。取上清液1mL，加都氏试剂3mL，同时取10％(v/v)SRBC 0.25mL加都氏试剂至4mL，充分混匀，放置10min后，于540nm处以对照管作空白，分别测定各管光密度值。
3.4.2.4 数据处理及结果判定
一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值< F0.05,结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。
溶血素的量以半数溶血值（HC50）表示，按下列公式计算，受试样品组的HC50显著高于对照组的HC50，可判定该项实验结果阳性。
                      样品光密度值
样品HC50＝─────────────────×稀释倍数
               SRBC半数溶血时的光密度值
 

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