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TK基因突变试验

作者：佚名保健品来源：本站原创点击数：更新时间：2007-1-19

1 范围
    本方法规定了体外哺乳类细胞TK位点基因突变试验的基本技术要求与方法。
本方法适用于评价保健食品的遗传毒性。

2 原理
    TK基因突变试验的检测终点是胸苷激酶（thymidine kinase，TK）基因的突变。在人类，TK基因定位于17号染色体长臂远端；在小鼠则定位于11号染色体。故TK基因的突变属于常染色体基因突变。
    TK基因的产物胸苷激酶在体内催化从脱氧胸苷（TdR）生成胸苷酸（TMP）的反应。在正常情况下，此反应并非生命所必需，原因是体内的TMP主要来自于脱氧尿嘧啶核苷酸（dUMP），即由胸苷酸合成酶催化的dUMP甲基化反应生成TMP。但如在细胞培养物中加入胸苷类似物（如三氟胸苷，即TFT——trifluorothymidine），则TFT在胸苷激酶的催化下可生成三氟胸苷酸，进而掺入DNA，造成致死性突变，故细胞不能存活。若TK基因发生突变，导致胸苷激酶缺陷，则TFT不能磷酸化，亦不能掺入DNA，故细胞在含有TFT的培养基中能够生长，即表现出对TFT的抗性。根据突变集落形成数，计算突变频率，以判定受试物的致突变性。

3 试剂与材料
    3.1 细胞：L5178Y tk+/- 3.7.2C小鼠淋巴瘤细胞。为清除自发突变的tk-/-基因型细胞，在正式实验前，应使用含3mg/ml 胸苷，5mg/ml次黄嘌呤，0.1mg/ml 氨甲碟呤和7.5mg/ml 甘氨酸的THMG培养基中处理24小时，离心、洗涤后在不含氨甲碟呤的THG培养基中培养3天。
    3.2 试剂：PBS磷酸盐缓冲液，三氟胸苷（trifluorothymidine），次黄嘌呤（hypoxanthine），甘氨酸（glycine），氨甲碟呤（methotrexate），胸腺嘧啶核苷（thymidine），阳性对照物（MMS，MMC，环磷酰胺等）。

4 试验设计：一般应进行细胞毒性预试验，根据预试验结果，在相对存活率（relative survival，RS）为阴性对照组的20%~80%范围内设3~4个剂量（浓度）水平。每次试验均需设阴性（双蒸水）对照，通常亦需设阳性对照。阳性对照通常使用MMS、EMS、MMC、CP（环磷酰胺）等。如使用非水溶剂，则亦需设溶剂对照。

5 操作步骤
    5.1 培养液和培养条件：含10% 马血清和适量抗菌素的RPMI 1640培养液（96孔板培养时使用含20%马血清的RPMI 1640培养液），5%CO2 、37℃、饱和湿度条件下作常规悬浮培养。
    5.2 处理：取生长良好的细胞，调整密度为5×105/ml，按1%体积加入受试物，37℃震摇处理3小时。离心，弃上清液，用PBS或不含血清的培养基洗涤细胞2遍，重新悬浮细胞于含10% 马血清的RPMI 1640培养液中，并调整细胞密度为2×105/ml。
    5.3 PE0（0天的平板接种效率）测定：取适量细胞悬液，作梯度稀释至8个细胞/ml，接种96孔板（每孔加0.2 ml ，即平均1.6个细胞/孔），每个剂量作1~2块板，37℃，5% CO2，
饱和湿度条件下培养12天，计数每块平板有集落生长的孔数。
    5.4 表达：步骤(1)所得细胞悬液作2天表达培养，每天计数细胞密度并保持密度在106/ml以下。计算相对悬浮生长（Relative Suspension Growth，RSG）。
    5.5 PE2（第二天的平板接种效率）测定：2天表达培养结束后，取适量细胞悬液，按步骤(2)作梯度稀释并接种96孔板，培养12天后计数每块平板有集落生长的孔数。
    5.6 TFT抗性突变频率（tk-MF）测定：2天表达培养结束后，取适量细胞悬液，调整细胞密度为1×104/ml，加入TFT（三氟胸苷，终浓度为3 mg/ml），混匀，接种96孔板（每孔加0.2 ml，即平均2000个细胞/孔），每个剂量作2~4块板，37℃，5% CO2，饱和湿度条件下培养12天，计数有突变集落生长的孔数。突变集落按大集落（LC：直径≥1/4孔径，密度低）和小集落（SC：直径＜1/4孔径，密度高）分别计数，极小集落可再继续培养3天后计数。

6 数据处理
    6.1 平板效率（PE0 和PE2）

式中：EW为无集落生长´´´的孔数；
TW为总孔数；
1.6为每孔接种细胞数
    6.2 相对存活率（％RS）

    6.3 相对悬浮生长（RSG）

    6.4 相对总生长（RTG）= RSG×％RS2
    6.5 TFT抗性突变频率（MF）

式中：EW为无集落生长的孔数；
TW为总孔数；
n为每孔接种细胞数（2000）；
应分别计算大集落突变频率（L-MF），小集落突变频率（S-MF）和总突变频率（T-MF）
    6.6 小集落突变百分率（%SCM）= (S-MF)/(T-MF)

7 结果判定
    7.1 试验成立的条件：阴性对照和溶剂对照的PE0=60~140%，PE2=70~130%，T-MF＜本实验室历史记录的2倍（或＜240×10-6），%SCM=30~60%，阳性对照的T-MF与阴性/溶剂对照有显著差异，或比阴性/溶剂对照高100×10-6以上。
    7.2 受试物阳性和阴性结果的判定：受试物一个以上浓度组的T-MF与阴性/溶剂对照有显著差异，或比阴性/溶剂对照高100×10-6以上，并有剂量反应关系，则可判定为阳性。但如仅在%RS达-20%的高剂量情况下出现阳性，则结果判为“可疑”。
　　阴性结果的判定需在 %RS达-20% 的情况下未见突变频率增加方可作出。

责任编辑：shenzx