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哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验

作者：佚名保健品来源：本站原创点击数：更新时间：2007-1-19

    1 范围
本方法规定了哺乳动物骨髓染色体畸变试验的基本技术要求。
本方法适用于评价保健食品对骨髓细胞的遗传毒性。
本方法不适用于有证据表明受试物或反应代谢产物达不到靶组织（target tissue）—骨髓的情况。

    2 原理
染色体是细胞核中具有特殊结构和遗传功能的小体，当化学物质作用于细胞周期G1期和S期时，诱发染色体型畸变，而作用于G2期时则诱发染色体单体型畸变。给试验的大、小鼠腹腔注入秋水仙素，抑制细胞分裂时纺锤体的形成，以便增加中期分裂相细胞的比例，并使染色体丝缩短、分散，轮廓清晰。在显微镜下观察染色体数目和形态。

    3 仪器与试剂
全部试剂除注明外均为分析纯，试验用水为蒸馏水。
3.1 0.1％秋水仙素：置于棕色瓶中，冰箱保存。
3.2 2.2％柠檬酸钠。
3.3 PH 7.4磷酸盐缓冲液。
3.3.1 1/15 mol/L磷酸氢二钠溶液：磷酸氢二钠（Na2HPO4）9.47 g溶于1000mL蒸馏水中。
3.3.2 l/15 mol/L磷酸二氢钾溶液：磷酸二氢钾（KH2PO4）49.07g溶于1000mL蒸馏水中。
3.3.3 将磷酸氢二钠溶液80mL与磷酸二氢钾溶液20mL混合，用pH计测定并调节pH至7.4。
3.4 0.075 mol/L 氯化钾溶液。
3.5 甲醇（分析纯）：冰乙酸（分析纯）以3∶1混合，临用时现配。
3.6 Giemsa 溶液。
3.6.1 Giemsa 储备液：取Giemsa染料3.8 g，置玛瑙乳钵中，加少量甲醇研磨，逐渐加甲醇至375 mL 。溶解后再加125 mL纯甘油，于37℃温箱保温48 h，在此期间摇动数次，放置1～2周过滤备用。
3.6.2 Giemsa 应用液：取l mL储备液加入10 mL pH 7.4磷酸缓冲液。
3.7 仪器与设备：实验室常用设备、恒温水浴锅37±5℃、离心机、生物显微镜。

    4 实验动物：常用健康年轻的成年大鼠或小鼠。每组用两种性别的动物至少各5只。动物购买后适应环境至少3天。

    5 剂量及分组
受试物应设三个剂量组，最高剂量组原则上为动物出现严重中毒表现和/或个别动物出现死亡的剂量，一般可取1/2 LD50，低剂量组应不表现出毒性，分别取1/4和1/8 LD50 作为中、低剂量。急性毒性试验给予受试物最大剂量(最大使用浓度和最大灌胃容量)动物无死亡而求不出LD50时，高剂量组则以以下顺序（1）10g/kgBW；（2）人的可能摄入量的100倍；或（3）一次最大灌胃剂量进行设计，再下设中、低剂量组。另设溶剂对照组和阳性对照组，阳性物可用丝裂霉素C（1.5-2.0mg/kgBW）或环磷酰胺（40mg/kgBW）经口或腹腔注射（首选经口）给予。

    6 操作步骤
6.1 受试物配制
一般用蒸馏水作溶剂，如受试物不溶于水，可用食用油、医用淀粉、羧甲基纤维素等配成乳浊液或悬浊液。受试物应于灌胃前新鲜配制，除非有资料表明以溶液（或悬浊液、乳浊液等）保存具有稳定性。
6.2 实验动物的处理
经口给予受试物2～4次，每次间隔24h，在末次给受试物后18～24 h取材。必要时可先用一个剂量的3只动物，于给受试物后6、24、48 h分别处死动物取材，以选择处死动物的最适时间。在一次给受试物时也可每个剂量组用15只动物，于6、24、48 h后分别各处死5只动物取材。处死动物前2～4h，按4 mg/kg体重腹腔注入秋水仙素。大鼠断头处死、小鼠颈椎脱臼。
6.3标本制备
6.3.1 取材
取股骨，去附着的肌肉，剪去两端骨骺，用带针头的注射器吸取2～4 mL 2.2％柠檬酸钠溶液，将骨髓洗入10mL离心管中，反复冲洗数次直至股骨断面由红色变粉色，然后以1000～1500r /min离心10 min，弃去上清液。
6.3.2 制片
离心后的沉淀物加入4 mL0.075 mol/L氯化钾溶液，混匀后在37℃水浴或恒温箱中放置10～20 min，再以1000～1500 r/min离心，弃去上清液。
将新配制的甲醇－冰乙酸固定液4 mL沿管壁加入受试物中，10～15 min后，用吸管将细胞团块打碎继续固定10～15 r/min，以1000r /min离心10 min弃去上清液，再加固定液4 mL静置20 min 后离心，弃去上清液，用吸管混匀制成0.5～1.0 mL细胞悬液。
先将洗净的载玻片保存于水中备用。自来水中取出载玻片，倾斜30℃ 放置，立即吸取细胞悬液在玻片的1/3处滴3滴，轻吹细胞悬液扩散平铺于玻片上。每个标本制2～3张玻片，空气中自然干燥。
临用时取Giemsa储备液1mL磷酸盐缓冲液10mL，置染色缸中，将涂片浸于染液中染色15 min左右，取出玻片用水冲洗，空气中自然干燥。
6.4 阅片
6.4.1 阅片要求
在低倍镜下检查制片质量，制片应为全部染色体较集中，而各个染色体分散、互不重叠、长短收缩适中、两条单体分开、清楚地显示出着丝点位置、染色体呈红紫色。用油镜进行细胞中期染色体分析。每只动物分析100个中期相细胞，每个剂量组不少于1000个中期相细胞。
6.3.2 观察项目
6.3.2.1染色体数目的改变
6.3.2.1.1 非整倍体：亚二倍体或超二倍体。
6.3.2.1.2 多倍体：染色体成倍增加。
6.3.2.1.3 内复制：包膜内的特殊形式的多倍化现象。
6.3.2.2 染色体结构的改变
6.3.2.2.1 断裂：损伤长度大于染色体的宽度。
6.3.2.2.2微小体：较断片小而呈原形。
6.3.2.2.3 有着丝点环：带有着丝点部分，两端形成环状结构并伴有一双无着丝点断片。
6.3.2.2.4 无着丝点环：成环状结构。
6.3.2.2.5 单体互换：形成三辐体，四辐体或多种形状的图像。
6.3.2.2.6 双微小体：成对的染色质小体。
6.3.2.2.7 裂隙：损伤的长度小于染色单体的宽度。
6.3.2.2.8 非特定性型变化：如粉碎化、着丝点细长化、粘着等。

    7 数据处理
统计学处理用X2检验。

    8 结果判定
试验组与对照组相比，试验结果染色体畸变率有明显的剂量反应关系并有统计学意义时，即可确认为阳性结果。若统计学上差异有显著性，但无剂量反应关系时，则须进行重复试验。结果能重复者可确定为阳性。

责任编辑：shenzx