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果蝇伴性隐性致死试验

作者：佚名保健品来源：本站原创点击数：更新时间：2007-1-19

    1 范围
本方法规定了果蝇伴性隐性致死实验的基本技术要求。
本方法适用于评价保健食品的遗传毒性。

    2 原理
2.1 隐性基因在伴性遗传中的交叉遗传性，即雄蝇的X染色体传给F1代雌蝇，又通过F1代传给 F2 代雄蝇。
2.2 位于X染色体上的隐性基因能在半合型情况下于雄蝇中表现出来。
据此，利用眼色性状由X染色体上的基因决定，并与X染色体的遗传相关联的特征来作为观察在X染色体上基因突变的标记，故以野生型雄蝇（红色圆眼，正常蝇）染毒，与Basc（Muller-5）雌蝇（淡杏色棒眼，在两个X染色体上各带一个倒位以防止F1代把处理过的父系X染色体和母系X染色体互换）交配，如雄蝇经受试物处理后，在X染色体上的基因发生隐性致死，则可通过上述两点遗传规则于F2代的雄蝇中表现出来，并籍眼色性状为标记来判断试验的结果。即根据孟德尔分类反应产生四种不同表型的F2代，有隐性致死时在F2代中没有红色圆眼的雄蝇。

    3 仪器与试剂
3.1 仪器与器材设备
电热恒温干燥箱、生化培养箱、立体解剖显微镜、放大镜、空调机、麻醉瓶、牛奶瓶、大、小玻璃试管（3 cm×8 cm×9 cm）、试管盘及架、白瓷板、海绵垫、毛笔、海绵塞。
3.2 试剂
乙醚、75％乙醇、丙酮、吐温。
3.3 培养基的制备
大小试管和海绵塞洗净后于120℃ 2 h干燥消毒后备用。
3.3.1 蔗糖26 g 、酵母粉4 g ，加水150 mL。
3.3.2 玉米粉34 g、酵母粉4 g ，加水150 mL。
3.3.3 步骤：按3.2.1 煮沸溶解后再按3.2.2 倒入混匀、煮沸，然后加丙酸2 mL，搅匀，分装于试管内，备用。

    4 实验动物
果蝇。雄蝇用3～4天龄的野生型黑腹果蝇（Drosophila melanogaster），雌蝇用Basc（Muller-5）品系3～5d龄的处女蝇。

    5 剂量及分组
按常规方法求出LC50 或LD50 值。然后按1/2 LC50 或LD50 为大剂量，1/5～1/10 LD50 为小剂量，另设阴性（或溶剂）及阳性（2mmol/LMMS）对照组。如果受试物毒性较小，受试物加入饲料的最大剂量可占饲料的5％。阳性对照物可用甲基磺酸乙酯、甲基磺酸甲酯，N-亚硝基二甲胺。

    6 操作步骤
6.1受试物配制：一般受试物应溶解在水中，如受试物不溶于水，可用食用油、医用淀粉、羧甲基纤维素配成乳化液或悬浮液，然后再在给样前用水或生理盐水稀释。避免用二
甲基亚砜作为介质。受试物应于灌胃前新鲜配制，除非有资料表明以溶液（或悬浊液、乳浊液等）保存具有稳定性。
6.2 处女蝇的收集
开始羽化后，清除管内所有成蝇，然后在6～12 h 内收集的雌蝇即为处女蝇。将处女蝇放入新试管，一只管中不超过25只，以免过分拥挤。
6.3 接触受试物
受试物接触方法常用溶液饲养。受试物溶解后用1%～5% 的蔗糖水稀释成不同浓度，试管内放入一团手纸，加入1mL受试液使纸充分湿透，放入经饥饿4 h的雄蝇进行喂饲，新配制的培养基冷却到55℃时，倒入受试物，快速磁搅拌2 min，接触受试物时间1～3天。
6.4 交配程序及方法
为检测受试物对哪一期生殖细胞最敏感，将雄蝇在接触受试物后按2-3-3天间隔（分别表示对精子、精细胞和精母细胞的效应）与处女蝇交配。即每一试管以一只经处理过的雄蝇按上述程序顺次与2只处女蝇交配，再以所产F1代按雌与雄（1∶1或1∶2）进行F1～F2交配。12～14 d后观察F2代，孵育温度为25℃ 。
每一个实验组至少应有3000 个样本数。

    7 数据处理
根据受试染色体数（即 F1 代交配的雌蝇数减去不育数和废管数）与致死阳性管数求出致死率。

以试验组与对照组的致死率按 Kastenbaum and Bowman 方法进行统计。

    8 结果判定
对 F2 代结果的判断标准如下：
8.1 每一试管在多于20个仔代（雌及雄）中没有红色圆眼的野生型雄蝇为阳性，属致死突变。如有2只以上的红色圆眼的野生型雄蝇者为阴性。
8.2 每一试管如确少于20个仔代或只有一只野生型雄蝇的可疑管，需进行F3代的观察。
8.3 不育：仅存雄、雌亲本而无仔蝇者。

责任编辑：shenzx