1 范围
本方法规定了Ames试验的基本技术要求。
本方法适用于评价保健食品的致突变作用。
本方法不适用于具有杀菌和/或抑菌作用的受试物，不适用于具有妨碍哺乳动物细胞复制系统的受试物。
 
    2 原理
鼠伤寒沙门氏菌的突变型（即组氨酸缺陷型）菌株在无组氨酸的培养基上不能生长，在有组氨酸的培养基上可以正常生长。但如在无组氨酸的培养基中有致突变物存在时，则沙门氏菌突变型可回复突变为野生型（表现型），因而在无组氨酸培养基上也能生长，故可根据菌落形成数量，检查受试物是否为致突变物。某些致突变物需要代谢活化后才能使沙门氏菌突变型产生回复突变，代谢活化系统可以用多氯联苯（PCB）诱导的大鼠肝匀浆（S-9）制备的S-9混合液。
 
    3 仪器
3.1 实验室常用设备。
3.2 低温高速离心机，低温冰箱（-80℃）或液氮罐，洁净工作台，恒温培养箱，恒温水浴，蒸气压力锅，匀浆器等。
 
    4 试剂
培养基成分或试剂除说明外至少应是化学纯，无诱变性。避免重复高温处理，选择适当保存温度和期限，如肉汤保存于4℃不超过六个月，其它详见下述各培养基及溶液说明。
4.1 营养肉汤培养基
    牛肉膏                              2.5 g
    胰胨(或混合蛋白胨)                   5.0 g
    氯化钠                              2.5 g
    磷酸氢二钾（K2HPO4•3H2O）         1.3 g
    蒸馏水                              500 mL   
    加热溶解，调pH至7.4，分装后0.103 MPa 20 min 灭菌，普通冰箱保存备用，保存期不超过半年。
4.2 营养肉汤琼脂培养基：用作a．基因型鉴定的结晶紫敏感试验，抗氨苄青霉素和四环素试验，紫外线敏感性试验。b．细菌活力鉴定。
琼脂粉                              1.5 g
营养肉汤培养基                      100 mL
加热融化后调pH为7.4 ，0.103 MPa 20 min 灭菌。
4.3 底层培养基所需试剂及配制方法如下：
4.3.1 磷酸盐贮备液
磷酸氢钠铵（NaNH4HPO4•4H2O）     17.5 g
柠檬酸（C6H8O7•H2O）              10.0 g
磷酸氢二钾（K2HPO4）               50.0 g   
硫酸镁1) （MgSO4•7H2O）           1.0 g 
加蒸馏水至100mL，0.103 MPa 20min 灭菌。
注：1)待其他试剂完全溶解后再将硫酸镁缓慢放入其中继续溶解，否则易析出沉淀。
4.3.2 40％葡萄糖溶液
葡萄糖                               40.0 g
    加蒸馏水至100mL，0.055 MPa 20min 灭菌。
4.3.3 1.5％琼脂培养基
琼脂粉                               6.0 g
加蒸馏水至                           400 mL
融化后0.103MPa 20min 灭菌。
4.3.4  底层培养基(无菌操作)
趁热（80℃），在灭菌琼脂培养基中（400 mL）依次加入：
磷酸盐贮备液                          8 mL 
40％葡萄糖溶液                       20 mL
充分混匀，待凉至80℃左右时倒平皿，每皿（φ90 mm）25 mL，37℃ 培养过夜以除去水分及检查有无污染。
4.4 顶层培养基的成分及制备
4.4.1 顶层琼脂
琼脂粉                               3.0 g
氯化钠                               2.5 g
加蒸馏水至                           500 mL
4.4.2 0.5 mmol／L组氨酸—生物素溶液(诱变试验用)
    D-生物素（分子量244）               30.5 mg
    L-组氨酸（分子量155）               19.4 mg
    加蒸馏水至250 mL。
4.4.3 顶层培养基制备：加热融化顶层琼脂，每100mL 顶层琼脂中加10mL 0.5 mmol／L组氨酸－生物素溶液。混匀，分装在100mL 三角瓶中，0.103 MPa 20 min 灭菌。用时融化分装小试管，每管2mL，在45℃水浴中保温。
4.5 特殊试剂和培养基的配制
4.5.1 0.8％ 氨苄青霉素溶液（鉴定菌株用，无菌配制）
称取氨苄青霉素40mg，用0.02mol/L 氢氧化钠溶液稀释至5mL，保存于冰箱。
4.5.2 0.1 ％ 结晶紫溶液（鉴定菌株用）
称取100mg 结晶紫，溶于100mL无菌水。
4.5.3 L—组氨酸溶液和0.5 mmol/L D-生物素溶液（鉴定菌株用）
称取L-组氨酸0.4043g 和D-生物素12.2mg，分别溶于100mL蒸馏水，0.103 Mpa 20min灭菌，保存于4℃冰箱。   
4.5.4 0.8％ 四环素溶液（用于四环素抗性试验和氨苄青霉素-四环素平板） 称取40mg四环素，用0.02 mol/L盐酸缓冲液稀释至5mL，保存于4℃冰箱。
4.5.5 氨苄青霉素平板（用作TA97、TA98、TA100菌株的主平板）和氨苄青霉素-四环素平板（用作TA102菌株的主平板）每1000 mL中由以下成分组成。
底层培养基                                        910 mL
磷酸盐储备液                                       20 mL
40％ 葡萄糖溶液                                    50 mL
组氨酸水溶液                                       50 mL
0.5 mmol/L 生物素                                   6 mL
0.8％ 氨苄青霉素溶液                              3.15 mL 
0.8％ 四环素溶液                                  0.25 mL
四环素仅在使用对四环素有抗性的TA102 时加入。以上成分均已分别灭菌或无菌制备。
4.5.6 组氨酸-生物素平板（组氨酸需要试验用）每1000 mL 中由以下成分组成：
底层培养基                                        914 mL
磷酸盐储备液                                       20 mL
40％ 葡萄糖溶液                                    50 mL
组氨酸水溶液（0.4043 g/100 mL）                     10 mL
0.5 mmol/L 生物素                                   6 mL
以上成分均已分别灭菌。
4.5.7  二甲基亚砜：光谱纯，0.103 MPa 20min 灭菌。
4.6  S-9 辅助因子（混合液试剂）的配制
4.6.1  0.4 mol/L 氯化镁（MgCl2）溶液：称取3.8 g ，加蒸馏水稀释至100 mL 。
4.6.2  1.65 mol/L 氯化钾（KCl）溶液：称取12.3 g ，加蒸馏水稀释至100 mL 。
4.6.3  0.2 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH 7.4），每500 mL 由以下成分组成：
磷酸氢二钠（Na2HPO4）（14.2 g/500 mL）             440 mL
磷酸二氢钠（NaH2PO4•H2O）（13.8 g/500mL）         60 mL    
调pH至7.4，0.103 MPa 20 min 灭菌或滤菌。
4.6.4  辅酶-Ⅱ（氧化型）溶液：准确称取辅酶-Ⅱ，用无菌蒸馏水溶解配制成0.025 mol/L溶液，低温保存（－20 ℃以下）。
4.6.5  葡萄糖-6-磷酸钠盐溶液：称取葡萄糖-6-硫酸钠盐，用无菌蒸馏水溶解配制成 0.05 mol/L ，低温保存（－20 ℃以下）。
4.7 10％ S-9 混合液的配制：每10 mL 由以下成分组成，临用时配制。
磷酸盐缓冲液（0.2 mol/L， pH 7.4）         6.0 mL
氯化钾溶液（1.65 mol/L）                   0.2 mL
氯化镁溶液（0.4 mol/L）                    0.2 mL
葡萄糖-6-磷酸钠盐溶液（0.05 mol/L）         1.0 mL
辅酶-Ⅱ溶液（0.025 mol/L）                  1.6 mL
肝S-9 液                                  1.0 mL
混匀，置冰浴中待用。
4.8 活化系统（S-9和S-9）混合液）的制备
用哺乳动物如大鼠，经诱导剂处理，取肝组织制备匀浆，9 000g 离心，上清液为S-9组分，与辅助成分以适当比例组成S-9混合液，用作试验中的代谢活化系统。
4.8.1 大鼠肝S-9的诱导和制备
4.8.1.1 选健康雄性成年SD或Wistar大鼠，体重150g左右，周龄约5～6周。将多氯联苯（Aroclor1254 或国产PCB-五氯）溶于玉米油中，浓度为200mg/mL，按500mg/kgBW无菌操作一次腹腔注射，5d 后断头处死动物，取出肝脏称重后，用新鲜冰冷的0.15 mol/L氯化钾溶液连续冲洗肝脏数次，以便除去能抑制微粒体酶活性的血红蛋白。每克肝（湿重）加0.1mol/L 氯化钾溶液3mL，连同烧杯移入冰浴中，用消毒剪刀剪碎肝脏，在玻璃匀浆器（低于4000 r/min，往复1-2min，或组织匀浆器（20 000 r/min，1 min）中制成肝匀浆。以上操作需注意无菌和局部冷环境。
4.8.1.2 将制成的肝匀浆在低温（0～4℃）高速离心机上以9 000g离心10 min，吸出上清液为S-9 组分，分装于无菌冷冻管或安瓿中，每安瓿2mL左右，最好用液氮或干冰速冻后置－80℃低温保存。
4.8.1.3 S-9 制成后，经无菌检查，测定蛋白含量（Lowry法），每毫升蛋白含量不超过40 mg为宜，并经间接致癌物（诱变剂）鉴定其生物活性合格后贮存于深低温或冰冻干燥，保存期不超过一年。
4.8.2  S-9 混合液配制
由S-9液和辅助因子（S-9 混合液试剂）组成，辅助因子按Ames（1983）配方，低温（－20 ℃ 以下）贮存。混合液临用时新鲜无菌配制，或滤过除菌。一般按1：9 配成10％ 混合液。用每皿 0.5 mL S-9 混合液（含20～50 mL S-9）测定其对已知阳性致癌物（诱变剂）的生物活性，确定最适用量，或者按一般用量，即每平皿 0.5 mL S-9 混合液（含S-9 50 mL）。S-9 活性和用量应在报告中予以说明。

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