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体外哺乳类细胞（V79/HGPRT）基因突变试验

作者：佚名保健品来源：本站原创点击数：更新时间：2007-1-19

    1 范围
本方法规定了体外哺乳类细胞（V79/HGPRT）基因突变试验的基本技术要求。
本方法适用于评价保健食品的遗传毒性。

    2 原理
细胞在正常培养条件下，对6-TG的毒性作用敏感，不能生存，在致癌物和/或致突变物作用下，某些细胞 X 染色体上控制次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）的结构基因发生突变，不能再产生HGPRT，从而使突变细胞对6-TG具有抗性作用。这些突变细胞在含有 6-TG 的选择性培养液中能继续分裂并形成集落。根据突变集落形成数，计算突变率以判定受试物的致突变性。

    3 材料和试剂
3.1 细胞：使用中国仓鼠肺（V79）细胞株。为了减少自发突变率，正式实验前先将野生型细胞群体中存在的自发 HGPRT 座位突变体选择性杀灭，方法是将野生型细胞接种于含次黄嘌呤及胸腺嘧啶，氨甲喋呤，甘氨酸的 MEM 培养液中培养1 周，然后重新接种于MEM培养液中。
3.2 培养液：采用MEM（Eagle）基础培养液或 DMEM 培养液，补以10%小牛血清及适量抗菌素（青霉素，链霉素）。
3.3 磷酸盐缓冲液（无钙、镁 PBS）
磷酸二氢钾（KH2PO4）                         200 mg
磷酸氢二钠（NaHPO4.12H2O）                   2.89 g
氯化钾（KCl）                                 200 mg
氯化钠（NaCl）                                 8.0 g
双蒸水                                        1000 mL
高压消毒，121℃，0.103 MPa，20 min 。
3.4 胰蛋白酶/EDTA 溶液：用无钙、镁 PBS 配制，胰酶的浓度为 0.05%，EDTA 的浓度为 0.02%，胰蛋白酶与EDTA溶液按1∶1混合。－20℃储存。
3.5 受试物：最好能溶于培养液。也可溶于二甲基亚砜（DMSO），其浓度应低于0.5％，（V/V）。
3.6 阳性对照物：可根据受试物的性质和结构选用不同的阳性对照物，例如乙基磺酸酯（EMS），丝裂霉素C（MMC），甲基硝基亚硝基胍（MNNG），本并（a）芘（BP）等。
3.7 6-TG：用0.5％碳酸氢钠溶液配成1.0 mg/mL，4℃储存。
3.8 大鼠肝匀浆 S-9 混合液：按Ames 试验程序制备。

    4 操作步骤
4.1 细胞准备：将5×105 个细胞接种于直径为100 mm平皿中，于37℃、5% 二氧化碳培养箱中放置24 h 。
4.2 接触受试物：吸去培养液，PBS洗两次，加入无血清培养液及一定浓度的受试物（需代谢活化者同时加入大鼠肝匀浆S-9 混合物），置于培养箱中 2h，结束后吸去含受试物的培养液，用 PBS 洗细胞两次，换入含10%血清的培养液，继续培养19～22 h 。
4.3 表达：接触受试物的细胞继续培养19～22h后用胰酶-EDTA消化，待细胞脱落后，加入含10% 血清培养液终止消化，混匀，放入离心管以 800-1000 r/min 的速度离心5～7 min 弃去上清液，制成细胞悬液，计数，以5×105个细胞接种于直径为100 mm的平皿，3d后分传一次，仍接种5×105个细胞培养3 d 。
4.4 细胞毒性测定：将上述首次消化计数后的细胞每皿接种200个，每组5个皿，37℃、5%二氧化碳条件下培养7d，固定，Giemsa染色，计数每皿集落数，以相对于溶剂对照组的集落形成率表示细胞毒性。即以溶剂对照的集落形成率为100%（1.00），求出各检品试验组的相对值。

式中：A－－相对集落形成率；
B－－试验组集落形成率；
C－－溶剂对照组集落形成率。

4.5 突变体的选择及集落形成率的测定：表达结束后，消化细胞，分种，每组5个皿，每皿种2×105个细胞，待细胞贴壁后加入6-TG，终浓度为5 mg/mg，放入培养箱培养8～10 d后固定，Giemsa 染色，统计每皿集落数，并计算突变率。同时另做集落形成率测定。每皿接种200个细胞，不加6-TG，每组5个皿，7d 后固定染色，计算集落形成率。

式中：D－集落形成率
E－实际存活的细胞集落数
F－接种细胞数

式中：G－突变率
H－突变集落数
I －接种细胞数
D－集落形成率

    5 结果判定
5.1 若阴性对照中，集落形成率低于 50%，结果应不采用。
5.2 各实验室选用的阳性对照突变率有一定范围，若受试物的结果为阴性或弱阳性时，阳性对照的诱变率应达正常值的下线以上，否则结果不能成立。
5.3 当突变率为自发突变率的3倍或3倍以上，或至少在3个浓度范围内突变率有随浓度递增而升高的剂量反应关系时，可判为阳性。

责任编辑：shenzx