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小鼠精子畸形试验

作者：佚名保健品来源：本站原创点击数：更新时间：2007-1-19

    1 范围
本方法规定了小鼠精子畸形试验的基本技术要求。
本方法适用于评价保健食品对雄性生殖细胞的遗传毒性。

    2 原理
小鼠精子畸形受基因控制，具有高度遗传性，许多常染色体及X、Y性染色体基因直接或间接地决定精子形态。精子的畸形主要是指形态的异常，已知精子的畸形是决定精子形成的基因发生突变的结果。因此形态的改变提示有关基因及其蛋白质产物的改变。小鼠精子畸形试验可检测环境因子对精子生成、发育的影响，而且对已知的生殖细胞致突变物有高度敏感性，故本试验可用作检测环境因子在体内对生殖细胞的致突变作用。

    3 仪器与试剂
    3.1 实验室常用设备。
    3.2 生物显微镜。
    3.3 甲醇。
    3.4 1％～2％伊红染色液：称取伊红1～2 g，溶于100mL 蒸馏水备用。
全部试剂除注明外，均为分析纯，试验用水为蒸馏水。

    4 实验动物
成年雄性小鼠，6～8周龄、体重25～35 g。动物购买后适应环境3－5天。

    5 剂量及分组
受试物应设三个剂量组，最高剂量组原则上为动物出现严重中毒表现和/或个别动物出现死亡的剂量，一般可取1/2 LD50，低剂量组应不表现出毒性，分别取1/4和1/8 LD50 作为中、低剂量。急性毒性试验给予受试物最大剂量(最大使用浓度和最大灌胃容量)动物无死亡而求不出LD50时，高剂量组则以以下顺序（1）10g/kgBW；（2）人的可能摄入量的100倍；或（3）一次最大灌胃剂量进行设计，再下设中、低剂量组。另设溶剂对照组和阳性对照组。每组至少有5只存活动物。阳性物可采用环磷酰胺40～60 mg/kgBW、甲基磺酸甲酯（MMS）50 mg/kgBW或丝裂霉素C（MMC）1.0～1.5 mg/kgBW经口或腹腔注射（首选经口）给予。

    6 操作步骤
    6.1 受试物配制
一般用蒸馏水作溶剂，如受试物不溶于水，可用食用油、医用淀粉、羧甲基纤维素等配成乳化液或悬浮液。受试物应于灌胃前新鲜配制，除非有资料表明以溶液（或悬浊液、乳浊液等）保存具有稳定性。
    6.2 实验动物的处理
经口给予，连续5天。各种致突变物作用于精子的不同发育阶段，可在接触某种致突变物后不同时间出现精子畸形，故有条件时，可于给受试物后第1、4、10周处死动物，检查精子形态。因为大部分化学致突变物对精原细胞后期或初级精母细胞早期的生殖细胞较为敏感，故一般均是于首次给受试物后的第35天处死。
    6.3 标本制备
用颈椎脱臼法处死小鼠，取出两侧副睾，放入有适量生理盐水（约1 mL）的小烧杯中或放入盛有2mL生理盐水的平皿中。用眼科剪将副睾纵向剪1～2刀，静止3～5min ，轻轻摇动。用四层擦镜纸或合成纤维血网袋过滤，吸滤液涂片。空气干燥后，用甲醇固定5 min 以上干燥，用1％～2％伊红染色1h，用水轻冲，干燥。
    6.4 阅片
    6.4.1阅片要求
在低倍镜下（用绿色滤光片）找到背景清晰、精子重叠较少的部位，用高倍镜顺序检查精子形态，计数结构完整精子。精子有头无尾（轮廓不清）或头部与其它精子或碎片重叠，或明显是人为剪碎者，均不计算，每只动物至少检查1000个精子。
    6.4.2 精子畸形的类型
精子畸形，主要表现在头部，其次为尾部。畸形类型可分为无钩、香蕉形、胖头、无定形、尾折叠、双头、双尾等。
    6.4.3 阅片注意事项
异常精子均应记录显微镜的坐标数，以备复查。并分别记录异常类型，以便统计精子畸形率及精子畸形类型的构成比。判断双头、双尾畸形时，要注意与二条精子的部分重叠相鉴别，判断无定形时要与人为剪碎及折叠相鉴别。

    7 数据处理
每个剂量组应分别与相应的阴性对照组进行比较，如用 Wilcoson 秩和检验法评价精子畸形阳性的标准是，畸形率至少为阴性对照组的倍量或经统计有显著意义，并有剂量反应关系。

    8. 结果判定
一般阴性对照组的精子异常率为0.8％～3.4％，供参考。但应有本实验室所用实验动物的自发畸形率作参考。

责任编辑：shenzx