1 范围
本方法规定了预测环境有害物质对人体产生胚胎毒性及致畸性实验方法。
本方法适用于评价保健食品的致畸作用。
2 原理
母体在孕期受到可通过胎盘屏障的某种有害物质作用，影响胚胎的器官分化与发育，导致结构和机能的缺陷，出现胎仔畸形。因此，在受孕动物的胚胎着床后，并已开始进入细胞及器官分化期时投与受试物，可检出该物质对胎仔的致畸作用。
3 仪器与试剂
3.1 仪器与器材：实验室常用设备、生物显微镜及体视显微镜、游标卡尺（百分尺）。
3.2 试剂：实验用水为蒸馏水
3.2.1 甲醛、冰乙酸、2，4，6-三硝基酚、氢氧化钾、甘油、水合氯醛、茜素红。
3.2.2 茜素红贮备液：茜素红饱和液，50% 乙酸饱和液5.0 mL，甘油10.0 mL，1％水合氯醛60.0 mL混合，放入棕色瓶中。
3.2.3 茜素红应用液：取贮备液3～5 mL，用1～2g/100 mL氢氧化钾液稀释至1000 mL，存于棕色瓶中。
3.2.4 茜素红溶液：茜素红0.1 g，氢氧化钾10 g，蒸馏水1000mL。（剥皮用染色液）。
3.2.5 透明液A：甘油200 mL、氢氧化钾10g，蒸馏水790 mL混合。
3.2.6 透明液B：甘油与蒸馏水等量混合。
3.2.7 固定液（Bouins液）：2,4,6-三硝基酚（苦味酸饱和液）75份、甲醛20份、冰乙酸5份。
4 实验动物
常用试验动物为大鼠。选用健康性成熟（90～100天）大鼠，雌性未交配过的大鼠80～90只，雄性减半。
5 剂量及分组
至少设3个试验组。高剂量原则上应使部分孕鼠（和/或胎鼠）出现毒性作用，如体重减轻等，低剂量组不应引起明显的毒性作用，各剂量组可采用1/4、1/16、1/64 LD50；急性毒性试验给予受试物最大剂量（最大使用浓度和最大灌胃容量）动物无死亡时，以30天喂养实验的最大未观察到有害作用剂量为高剂量组，以下设2个剂量组。另设阴性对照组，对某种新的动物，初次试验可设一阳性对照组。每组至少12只孕鼠。常用阳性对照物有敌枯双（0.5～1.0 mg/kgBW）、五氯酚钠（30 mg/kgBW）、阿斯匹林（250～300 mg/kgBW）及视黄醇当量 7500～13000 mg/kgBW等。
6 操作步骤
6.1 “受孕动物”的检查和给受试物时间
性成熟雌、雄大鼠按1∶1（或2∶1）同笼后，每日早晨观察阴栓（或阴道涂片），查出阴栓（或精子），认为该鼠已交配，当日作为“受孕”零天。如果5天内未交配，应更换雄鼠。检出的“孕鼠”随机分到各组，并称重和编号，在受孕的第7～16天，每天经
口给予受试物（按 0.5～1.0 ml/100gBW计）。受孕的0、7、12、16、20 天称体重，并计算给受试物的量。
动物交配期室温在20～25℃为宜，环境安静，必要时增加麦芽、蛋糕等营养物质。
6.2 孕鼠处死和检查
于大鼠妊娠第20天直接断头处死。剖腹取出子宫称重，记录并检查吸收胎、早死胎、晚死胎及活胎数。
6.3 活胎鼠检查
逐一记录胎仔性别、体重、体长、检查胎鼠外观有无异常。
表1 致畸试验胎鼠体表检查项目
头 部 躯干部 四 肢
无脑症 胸骨裂 多肢
脑膨出 胸部裂 无肢
头盖裂 脊椎裂 短肢
脑积水 脊椎侧弯 半肢
小头症 脊椎后弯 多指
颜面裂 脐疝 无指
小眼症 尿道下裂 合指
眼球突出 无肛门 短指
无耳症 短尾、卷尾 缺指
小耳症 无尾
耳低位 腹裂
无颚症
小颚症
下颚裂
口唇裂
6.4 胎鼠骨标本的制作与检查
将每窝1/2 的活胎（奇数或偶数）放入 95%（V/V）乙醇中固定2～3周，取出胎仔流水冲洗数分钟后放入1～2 g/100 mL 的氢氧化钾溶液内（至少5倍于胎仔体积）8～72 h，透明后放入茜素红-S 应用液中染色 6～48 h，并轻摇1～2 次/天，至头骨染红为宜。再放入透明液A中1～2 天，放入透明液B中2～3天，待骨骼染红而软组织基本褪色，将标本放入小平皿中，用透射光源，在体视显微镜下作整体观察，然后逐步检查骨骼。测量头顶间骨及后头骨缺损情况，然后检查胸骨的数目，缺失或融合（胸骨为6个，骨化不全时首先缺第5胸骨、次为缺第2胸骨）肋骨通常12～13对，常见畸形有融合肋、分叉肋、波状肋、短肋、多肋、缺肋、肋骨中断。脊柱发育和椎体数目（颈椎7个，胸椎12～13个，腰椎5～6个，底椎4个，尾椎3～5个）有无融合、纵裂等。最后检查四肢骨。
[1] [2] 下一页 |
【
